猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT‑PCR检测试剂盒及其引物组制造技术

本发明专利技术公开了猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT‑PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。据此，发明专利技术人还制备了检测试剂盒，并建立了相应的多重RT‑PCR检测方法，该法可以特异检测PRRSV，而与猪的其他重要病原无交叉反应；对重组质粒标准品的检出下限为1.13×10

The classic syndrome virus strain, mutant strain and vaccine strain RT multiplex PCR detection kit and primer set of porcine reproductive and respiratory syndrome

The present invention discloses porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains, classic variant strains and vaccine strains multiplex RT primers for PCR detection group, including two pairs of specific primers, 1 primers and 2 respectively, 3 and 4 respectively primers, with nucleotide sequence sequence table SEQ.ID.No.1 to SEQ.ID.No.4. Accordingly, system test kit was prepared and inventor, established a multiple RT PCR corresponding detection method, this method can specifically detect PRRSV, and other important pathogens and pigs without cross reaction; detection of recombinant plasmid standard limit of 1.13 * 10

【技术实现步骤摘要】
猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR检测试剂盒及其引物组
本专利技术属于RT-PCR检测
，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR检测试剂盒及其引物组。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是一种急性、高度传染的病毒性传染病，其主要特征是怀孕母猪发生流产、早产、产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各种年龄猪、特别是仔猪的呼吸系统疾病。该病病原PRRS病毒(PRRSV)可以分为欧洲型(基因I型)毒株(EU-PRRSV)和美洲型(基因II型)毒株(NA-PRRSV)。我国PRRSV流行毒株以NA-PRRSV经典株、高致病性变异株为主，但在部分省份也检测到EU-PRRSV。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、稳定性好的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR检测试剂盒及其引物组，可同时检测并区分PRRSV野毒株、疫苗株。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1∶1∶1∶1。猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：反转录RT反应液、PCR反应液、灭菌双蒸水，PCR反应液包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。反转录RT反应液每管15μL，包括：5×PrimeScripIIbuffer4.0μL，dNTP1.0μL含各dNTP10mM，随机引物6聚体50pmol/μL、1.5μL，RNA酶抑制剂40U/μL、0.5μL，RNaseH-型反转录酶200U/μL、1.0μL，灭菌双蒸水7μL；PCR反应液每管45μL，包括：2×TaqPCRMasterMix25μL，引物1至425pmol/μL各1.0μL，灭菌双蒸水16μL。针对目前猪繁殖与呼吸综合征病毒检测存在的问题，根据NA-PRRSV经典株(C-PRRSV)与变异株(HP-PRRSV)在Nsp2基因的序列差异(变异株在Nsp2基因共缺失90个核苷酸)以及TJM-F92疫苗株(V-PRRSV)在Nsp2基因的序列特点(在缺失90个核苷酸的基础上还另外连续缺失360个核苷酸)，由此，专利技术人设计了猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。其中，引物1和2(B2-F/B2-R)用于区分美洲型经典株、变异株，引物3和4(TJM-F/TJM-R)用于区分野毒株和TJM-F92株，可实现三种不同类型毒株的鉴定在同一个扩增反应中一次性完成。据此，专利技术人还制备了检测试剂盒，并建立了相应的多重RT-PCR检测方法，该法可以特异检测PRRSV，而与猪的其他重要病原无交叉反应；对重组质粒标准品的检出下限为1.13×103拷贝。临床检测结果表明，本专利技术具有特异性强、敏感性高、重复性好等特点，可同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株，为临床快速鉴别检测及流行病学调查提供了有效的技术平台。附图说明图1是多重PCR特异性试验结果图，图中：M2000bpDNA分子质量标准，1四种重组质粒混合物，2CH-1R，3HuN4-F112，4TJM-F92，5PCV2，6PRV，7FMDV，8CSFV，9阴性对照。图2是多重PCR敏感性试验结果图，图中：M2000bpDNA分子质量标准，1-9质粒浓度分别为1.13×109-1.13×101拷贝/μL，10阴性对照。图3是多重PCR重复性试验结果图，图中M2000bpDNA分子质量标准，1-6相同条件下的6次重复反应。具体实施方式以下实施例中，PRRSV美洲型经典毒株(CH-1R株)、美洲型变异毒株(HuN4-F112株)、疫苗毒TJM-F92株、猪瘟病毒(CSFV，疫苗毒C株)、猪口蹄疫病毒(FMDV，疫苗毒O/MYA/BY/2010株)、猪圆环病毒2型(PCV2，疫苗毒LG株)、猪伪狂犬病病毒(PRV，疫苗毒Bartha-K61株)均由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心提供。1、引物的设计针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株及疫苗株TJM-F92的Nsp2基因系列特点，利用PrimerExpress3.0软件设计并合成两对特异性引物。参照GenBank中发表的PRRSVVR-2332株、JXA1株、TJ株基因组序列，设计两对特异性引物，扩增Nsp2基因(表1)。表1引物信息表1中，引物对B2-F/B2-R扩增C-PRRSV320bp片段、扩增HP-PRRSV和V-PRRSV(TJM-F92株)230bp片段；引物对TJM-F/TJM-R扩增C-PRRSV和HP-PRRSV493bp片段、扩增V-PRRSV(TJM-F92株)133bp片段。因此，利用引物对B2-F/B2-R和TJM-F/TJM-R扩增出320bp、493bp时为C-PRRSV，扩增出230bp、493bp时为HP-PRRSV，扩增出230bp、133bp时为V-PRRSV(TJM-F92株)。2、样本制备取2014-2016年广西各地发病死亡的疑似病猪的脾、肺、淋巴结适量，按比例(1∶4)加入1mol/LPBS(pH7.2)混合研磨后，反复冻融3次，离心取上清提取总RNA。应用所建立的多重RT-PCR，对PRRSV进行检测。提取病毒总RNA后反转录获得cDNA，以此为模板进行PCR扩增PRRSVNsp2基因片段，回收产物，连接载体、转化感受态细胞，选取阳性克隆，提取质粒，进行PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定，证实成功构建了重组质粒标准品。以CH-1R株、HuN4-F112株的cDNA为模板，由引物B2-F/B2-R扩增产物构建的重组质粒p-CH1R-B和p-HuN4-B；以HuN4-F112株、TJM-F92株的cDNA为模板，由引物TJM-F/TJM-R扩增产物构建的重组质粒p-HuN4-T和p-TJM-T。3、试剂盒配置根据研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。试剂盒含有以下试剂：反转录RT反应液、PCR反应液、灭菌双蒸水，其中：反转录RT反应液每管15μL，包括：5×PrimeScripIIbuffer4.0μL，dNTP(各10mM)1.0μL，随机引物6聚体(50pmol/μL)1.5μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL，RNaseH-型反转录酶(200U/μL)1.0μL，灭菌双蒸水7μL；PCR反应液每管45μL，包括：2×TaqPCRMasterMix25μL，引物B2-F/B2-R上、下游引物(25pmol/μL)各1μL、引物TJM-F/TJM-R上、下游引物(25pmol/μL)各1μL，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT‑PCR检测引物组，其特征在于包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR检测引物组，其特征在于包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。2.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测引物组，其特征在于：所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1∶1∶1∶1。3.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：反转录RT反应液、PCR反应液、灭菌双蒸水，所述PCR反应液包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们...

【专利技术属性】
技术研发人员：施开创，胡杰，粟艳琼，尹彦文，屈素洁，陆文俊，李军，
申请(专利权)人：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广西,45