一种用于检测冠状动脉闭塞狭窄的生物标记物及其制备方法和含有该标记物的试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于检测冠状动脉闭塞狭窄的生物标记物及其制备方法和含有该标记物的试剂盒。所述标记物其名称为circ‑Sirt1，它包括如SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因。其包括以下步骤：A）血浆中总RNA；B）除总RNA中残留的DNA；C）随机引物逆转录成cDNA；D）引物设计及PCR扩增克隆测序；所述试剂盒，包括有：血浆总RNA提取试剂组、RNA逆转录试剂组、实时荧光定量PCR试剂组、探针组、实时荧光定量PCR引物组；本发明专利技术所提供的circ‑Sirt1生物标记物及检测试剂盒在用于检测、评估患者冠状动脉狭窄程度时具有灵敏度高、特异性强的突出效果。

A biomarker for detecting coronary artery occlusion stenosis, a method of making the same, and a kit containing the same

The present invention discloses a biomarker for detecting coronary artery occlusion stenosis and a preparation method thereof and a kit containing the same. The marker whose name is CIRC Sirt1, comprising a nucleic acid sequence such as SEQ ID shown in the NO:1 gene. It includes the following steps: A) plasma total RNA; B) in residual RNA in DNA; C) were transcribed into cDNA; D) amplification and cloning sequencing primer design and PCR; the kit includes: plasma total RNA extraction reagent group, RNA group, reverse transcriptase real-time fluorescence quantitative reagent PCR kit, probe group, real-time fluorescence quantitative PCR primer group; the CIRC Sirt1 biomarkers and detection kit for detection and evaluation in patients with coronary artery stenosis with high sensitivity and specificity of the outstanding effect.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测冠状动脉闭塞狭窄的生物标记物及其制备方法和含有该标记物的试剂盒
本专利技术涉及用于诊断疾病的生物标记物及诊断试剂盒和标记物的制备方法。具体地说是一种可用于检测冠状动脉闭塞狭窄的生物标记物及含有该标记物的试剂盒以及该生物标记的制备方法。
技术介绍
冠状动脉狭窄属于冠状动脉病变，是导致冠心病的重要成因。准确评估冠状动脉狭窄程度对于早期发现和干预治疗冠心病具有极为重要的意义。目前，冠状动脉造影技术(CAG)是临床检查冠状动脉病变的金标准，但其检查具有创伤性、费用高、时间长的缺点。近年来，随着CT技术的发展，多排CT冠状动脉成像检查越来越多地应用于临床。多排CT冠状动脉成像技术可显示斑块成分、判断斑块的稳定性和冠状动脉官腔的狭窄程度，其作为一种无创检查方法，对于筛查、早期发现和干预治疗冠心病具有极为重要的意义。但该方法受患者个体体征影响较大。如256-MSCT受患者呼吸影响较大，且患者心率过快或心率变异较大，均可引起官腔周围血管显示粗糙、模糊、从而导致对血管狭窄程度评估不准确。(吴红丽等256层螺旋CT对冠状动脉狭窄的评价)。另外，运动伪影、冠状动脉钙化等难以克服的因素，也常常影响了该评估方法的准确度。因此，寻找易于操作应用、准确度高且不易受干扰的评估冠状动脉闭塞狭窄的方法成为科研人员亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是要提供一种准确度高、不受干扰、且检测速度快、使用方便的可检测冠状动脉闭塞狭窄的生物标记物。本专利技术的目的之二是提供一种制备上述生物标记物的方法。本专利技术的目的之三是提供一种新的用于评估冠状动脉闭塞狭窄的生物试剂盒。本专利技术的目的是这样实现的：本专利技术所提供的用于检测冠状动脉闭塞狭窄的生物标记物，其名称为circ-Sirt1，它包括如SEQIDNO：1所示的核酸序列基因。本专利技术人通过对冠状动脉闭塞狭窄患者的血浆研究，发现了此类患者血浆中的SIRT1基因表达量异常，且其表达量与冠状动脉闭塞狭窄的程度呈负相关性，由此完成了本专利技术。本专利技术所提供的SIRT1基因的制备方法包括以下步骤：通过设计扩增环状RNA的特异性引物扩增出SIRT1生物标记的环状RNA，通过PCR产物克隆DNA测序的方法获得如SEQIDNO：1所示的核酸序列基因(即circ-Sirt1)及其准确的环化位点；其具体制备方法如下：1)提取人血浆中总RNA；2)在上述提取的总RNA中加入反应液，通过消化、灭活去除总RNA中残留的DNA；3)将除去残留DNA后的RNA，采用随机引物逆转录成cDNA；4)引物设计及PCR扩增克隆测序；设计PCR扩增引物：引物序列circ-Sirt1-F：CTGATGAACCGCTTGCTAT；circ-Sirt1-R：CATGTGAGGCTCTATCCTCC；选取GAPDH为内参基因，作为荧光定量PCR结果的矫正基因，上下游引物序列GAPDH-F：ATCTTCCAGGAGCGAGATCCC；GAPDH-R：TGAGTCCTTCCACGATACCAA；用上述引物进行PCR扩增反应，反应完后取PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物切胶回收，胶回收试剂盒纯化，后使用T4连接酶将PCR产物连接入pMD18-T载体中，再将连接产物转化进大肠杆菌Top10感受态细胞中，过夜培养，挑取阳性克隆进行DNA测序，测序结果显示SIRT1基因的2-7外显子首尾连接环化，cDNA的核酸序列如SEQIDNO：1所示的核酸序列基因(即circ-Sirt1)。上述制备方法步骤1)更为具体的方法是：按照以下步骤提取总RNA：(a)采用EDTA-K2抗凝管采集外周静脉血样本。采集的血液样本2小时内，4℃2000g离心20min，收集上清液再次4℃10000g离心20min，收集上清分装-80℃保存。(b)300μl血浆加入900μlTrizolLS，室温下混匀充分裂解5min。(c)加入0.2ml氯仿:异戊醇(24:2)，振荡15s，室温静置2min。(d)4℃12000g离心15min，取上清。(e)加入0.6ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，-20℃静置2h。(f)4℃12000g离心15min，取上清。(g)加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃12000g离心5min，弃上清。(h)短暂晾干，加入10μlDEPC处理过的H2O溶解。(i)2μlRNA溶液使用NanoDrop2000记录A260/A280吸光值，A260/A230吸光值，剩余样品-80℃保存待进行逆转录反应。上述制备方法步骤2)中，反应总体积为20μl，组分和反应体系如下；上述制备方法步骤3)中，20μl逆转录反应体系和条件如下：上述制备方法步骤4)中，20μlPCR扩增circ-Sirt1的反应体系为：反应条件：95℃2min，95℃15s，61℃1min，40个循环。PCR产物4℃保存。上述制备方法步骤4)中，用T4连接酶将胶回收纯化的PCR产物连接到pMD18-T载体上，连接体系如下：反应条件：16℃连接4h。本专利技术所提供的用于评估冠状动脉闭塞狭窄的生物试剂盒，包括有：血浆总RNA提取试剂组、RNA逆转录试剂组、实时荧光定量PCR试剂组、实时荧光定量PCR引物组、(a)用于检测SEQIDNO：1所示的核酸序列基因的探针；该探针具有SEQIDNO：1所示的核酸序列基因杂交的DNA或反义DNA。(b)用于检测SEQIDNO：1所示的核酸序列基因的扩增引物；该扩增引物上游序列SEQIDNO：2所示和下游序列SEQIDNO：3所示。(c)内参基因扩增引物，该扩增引物上游序列SEQIDNO：4所示和下游序列SEQIDNO：5所示。本专利技术荧光定量PCR试剂盒适用于目前市场上所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，特异性好，具有良好的应用前景。本专利技术的创新性体现在：1)本专利技术提供了一种可用于评估患者冠状动脉狭窄程度的生物标记物及检测试剂盒，并由此也为临床提供了一种检测冠状动脉狭窄的新方法。2)本专利技术所提供的circ-Sirt1生物标记物及检测试剂盒在用于检测、评估患者冠状动脉狭窄程度时具有灵敏度高、特异性强的突出效果。3)本专利技术所设计出的circ-Sirt1基因扩增引物能够灵敏地、特异性地检测冠状动脉狭窄患者血浆中circ-Sirt1表达量，其可准确地评估患者冠状动脉狭窄程度。它为临床冠心病的早期诊断、治疗提供了有效依据。4)本专利技术所提供的circ-Sirt1基因还可作为冠状动脉狭窄患者潜在治疗靶点5)本专利技术所提供的生物标记物、试剂盒及其检测方法，不受人体体征影响，其准确度更为理想。附图说明图1为本专利技术所制备出circ-Sirt1生物标记物的琼脂糖凝胶电泳图，其中Marker为DM2000，扩增的circ-Sirt1序列长度240bp。图2为circ-Sirt1环化位点和PCR产物测序结果图。图3为使用circ-Sirt1引物对受试者血液样本中circ-Sirt1的表达量筛查结果图，其中Nor为健康对照组，AS为实验病例组；图4为circ-Sirt1简易结构示意图。具体实施方式下述实施例仅用于具体阐述实验方法，不应理解为对本专利技术的限制。本领域的技术人员在本专利技术的基础上进行的非实质性修改和替换均属于本专利技术所保护的范围。试剂：实验中所用的试剂均为市售产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测冠状动脉闭塞狭窄的生物标记物，其名称为circ‑Sirt1，它包括如SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测冠状动脉闭塞狭窄的生物标记物，其名称为circ-Sirt1，它包括如SEQIDNO：1所示的核酸序列基因。2.权利要求1所述生物标记物的制备方法，其包括以下步骤：A）提取人血浆中总RNA；B）在上述提取的总RNA中加入反应液，通过消化、灭活去除总RNA中残留的DNA；C）将除去残留DNA后的RNA，采用随机引物逆转录成cDNA；D）引物设计及PCR扩增克隆测序；设计PCR扩增引物：引物序列circ-Sirt1-F：CTGATGAACCGCTTGCTAT；circ-Sirt1-R：CATGTGAGGCTCTATCCTCC；选取GAPDH为内参基因，作为荧光定量PCR结果的矫正基因，上下游引物序列GAPDH-F：ATCTTCCAGGAGCGAGATCCC；GAPDH-R：TGAGTCCTTCCACGATACCAA；用上述引物进行PCR扩增反应，反应完后取PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物切胶回收，胶回收试剂盒纯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩梅，孔鹏，于媛，王海月，张旭慧，
申请(专利权)人：河北医科大学，
类型：发明
国别省市：河北,13