一种快速鉴定乳酸菌产生氨基甲酸乙酯前体物瓜氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速鉴定乳酸菌产生氨基甲酸乙酯前体物瓜氨酸的方法，属于微生物检测技术领域。利用本发明专利技术的方法，可以判定乳酸菌菌株是否存在精氨酸脱亚胺酶途径，是否能够利用精氨酸并形成瓜氨酸，从而可以确定该乳酸菌菌株在发酵食品和饮料中是否有产生致癌物氨基甲酸乙酯(EC)的可能性。本发明专利技术公开的方法快速、简便、准确，简并引物特异性高、通用性好，可以检测不同食品来源不同种属的乳酸菌，具有良好的食品安全检测前景。

Method for rapidly identifying lactic acid bacteria producing carbamate precursor citrulline

The present invention discloses a method for rapidly identifying lactic acid bacteria producing carbamate precursor substance citrulline, belonging to the field of microbial detection technology. By using the method of the invention can determine the existence of lactic acid bacteria strains of the arginine deiminase pathway, whether can the use of arginine and citrulline formation, thus determining the lactic acid bacteria in fermented foods and beverages are carcinogens of ethyl carbamate (EC) the possibility of. The method disclosed by the invention is fast, simple and accurate, has high specificity and versatility of the primers, and can detect lactic acid bacteria of different food sources and different species, and has a good prospect of food safety detection.

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定乳酸菌产生氨基甲酸乙酯前体物瓜氨酸的方法
本专利技术涉及一种快速鉴定乳酸菌产生氨基甲酸乙酯前体物瓜氨酸的方法，属于微生物检测

技术介绍
乳酸菌是发酵食品或饮料(例如酱油、发酵香肠、黄酒等)中广泛存在的一种微生物，其代谢产生的乳酸是一种风味物质，因此对发酵起积极作用。但是，最近国内外的研究发现，部分乳酸菌能够分解精氨酸产生瓜氨酸，而瓜氨酸又是广泛存在于发酵食品中的一种致癌物—氨基甲酸乙酯(EC)的一种重要前体物质，尤其在消费者日常食用(饮用)较多的酱油和黄酒中，EC的含量相对较高。瓜氨酸由乳酸菌经精氨酸脱亚胺酶途径降解精氨酸形成，但是并非所有乳酸菌都具有该途径，其存在表现为菌株特异性，即不同菌株降解精氨酸或产生瓜氨酸的能力不尽相同。乳酸菌精氨酸脱亚胺酶途径的编码基因，除了arcA、arcB、arcC、arcD基因，部分乳酸菌如清酒乳杆菌还有arcR(调控基因)，PTP(可能与瓜氨酸分泌和重吸收有关的转运蛋白的编码基因)，不同乳酸菌菌株arc基因簇排列顺序和完整性可能有所不同。研究证明，各乳酸菌菌株降解精氨酸和产生瓜氨酸的能力差异根源在于arc基因簇的多态性。目前，检测乳酸菌是否产生氨基甲酸乙酯前体瓜氨酸的方法主要是菌株分离后纯培养，然后在含有精氨酸的培养基中生长一段时间(例如在添加精氨酸的MRS培养基中发酵3天)，离心取上清液，使用高效液相色谱检测胞外精氨酸和瓜氨酸的含量，进而确定该菌是否具有产瓜氨酸的能力。此方法耗时较长，不仅需要配制流动相，还需要做标准曲线，检测周期约1周左右，并不是一个快速的检测方法。另一种方法是以简并引物扩增arcA、arcB、、arcC基因的部分序列，该方法快速简便，但是普适性差，主要是用于检测希氏乳杆菌、短乳杆菌、酒酒球菌、戊糖片球菌、肠膜明串珠菌等来源于葡萄酒中的乳酸菌，对于从黄酒中分离的乳酸菌检测效果很差，主要表现为以该引物检测时，许多能够产生瓜氨酸的乳酸菌都不能扩增出arcA和arcB，已有报道的这些引物在实际应用时具有相当大的局限性。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种快速检测乳酸菌精氨酸脱亚胺酶途径的方法，所述方法是以乳酸菌基因组DNA为模板，分别用引物对A和引物对B进行PCR，如果能够得到分别为200～300bp、450bp～550bp的PCR产物，那么该乳酸菌具有精氨酸脱亚胺酶途径，否则该乳酸菌不具有精氨酸脱亚胺酶途径。其中引物对A由核苷酸序列为SEQIDNO.1和核苷酸序列为SEQIDNO.2的核苷酸片段组成，或者是由SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸片段组成；所述引物对B由核苷酸序列为SEQIDNO.3和核苷酸序列为SEQIDNO.4的核苷酸片段组成，或者是由SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸片段组成。在一种实施方式中，所述乳酸菌包括乳酸乳球菌、弯曲乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、乳杆菌、短乳杆菌、魏斯氏菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、棒状乳杆菌、柠檬明串珠菌、假肠膜明串珠菌、肠膜明串珠菌。在一种实施方式中，所述200～300bp具体是指250bp；所述用450bp～550bp具体是指500bp。在一种实施方式中，所述PCR的反应体系为：DNA模板<500ng，上游引物和下游引物各0.2～1μM，10×ExTaqBuffer5μL，dNTP4μL，灭菌蒸馏水补至50μL。在一种实施方式中，所述PCR的反应条件为：预变性，94℃，4min；变性，94℃，35s；退火，50℃，35s，延伸，72℃，40s；变性、退火、延伸进行30个循环，继续延伸，72℃，10min，最后10℃保持直到取出。在一种实施方式中，所述PCR产物的检测是使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。本专利技术的第二个目的是提供一种组合引物对，包括引物对A和引物对B；其中引物对A由核苷酸序列为SEQIDNO.1和核苷酸序列为SEQIDNO.2的核苷酸片段组成，或者是由SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸片段组成；所述引物对B由核苷酸序列为SEQIDNO.3和核苷酸序列为SEQIDNO.4的核苷酸片段组成，或者是由SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸片段组成。本专利技术还要求保护所述组合引物对在食品中乳酸菌检测方面的应用。在一种实施方式中，所述食品包括发酵食品或饮料。在一种实施方式中，所述食品是酱油、发酵香肠、酱油、黄酒等。本专利技术的优点和效果：本专利技术公开的引物特异性高、通用性好，检测方法灵敏、准确、便捷，可以检测不同食品来源不同种属的乳酸菌，具有良好的食品安全检测前景。附图说明图1为利用本专利技术设计的简并引物检测来源于黄酒发酵液的乳酸菌精氨酸脱亚胺酶途径的凝胶图像(A、B分别为利用两对引物进行PCR扩增的产物)，其中孔道M为2000bpmarker(从上到下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)，孔道1-33依次为黄酒发酵液中分离的乳酸乳球菌1-20，弯曲乳杆菌1-21，发酵乳杆菌2-1，发酵乳杆菌2-17，发酵乳杆菌2-18，植物乳杆菌2-19，弯曲乳杆菌2-20，乳杆菌2-22，植物乳杆菌2-24，发酵乳杆菌2-28，短乳杆菌2-29，发酵乳杆菌2-32，短乳杆菌2-34，发酵乳杆菌2-36，发酵乳杆菌2-1-1，发酵乳杆菌2-1-17，乳杆菌2-1-19，魏斯氏菌2-1-26，魏斯氏菌4-15，魏斯氏菌4-19，短乳杆菌4-22，植物乳杆菌7-6，德氏乳杆菌7-13，发酵乳杆菌7-14，干酪乳杆菌14-1，发酵乳杆菌14-6，植物乳杆菌14-8，棒状乳杆菌14-9，柠檬明串珠菌14-16，假肠膜明串珠菌1-5、柠檬明串珠菌1-6、肠膜明串珠菌1-15。具体实施方案下面是对本专利技术进行具体描述。实施例1：1、乳酸菌基因组DNA的提取：使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)，根据说明书提取黄酒发酵液中分离的乳酸菌菌株的基因组DNA。2、引物设计及PCR扩增：设计了简并引物对A和简并引物对B；其中引物对A的上下游引物的核苷酸序列分别为5’-AACCAYGCHATGATGCAYYT-3’/5’-TTKGABCCRTCRTTCCATTG-3’，用于检测arcA基因，产物长度为250bp；引物对B的上下游引物的核苷酸序列分别为5’-AYTCHGGKGTDGTTTGGAA-3’/5’-TCVGTMACTTCCATTTCHGT-3’，用于检测arcB基因，产物长度为500bp；其中，Y＝C/T，K＝G/T，R＝A/G，B＝G/T/C，H＝A/C/T，D＝A/G/T。乳酸菌菌株基因组DNA模板<500ng，上游引物和下游引物各0.2～1μM，10×ExTaqBuffer5μL，dNTP4μL，灭菌蒸馏水补至50μL。PCR扩增的条件为：预变性，94℃，4min；变性，94℃，35s；退火，50℃，35s，延伸，72℃，40s；变性、退火、延伸进行30个循环，继续延伸，72℃，10min，最后10℃保持直到取出。3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物：如果使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测乳酸菌精氨酸脱亚胺酶途径的方法，其特征在于，所述方法是以乳酸菌基因组DNA为模板，分别用引物对A和引物对B进行PCR，如果能够得到分别为200～300bp、450bp～550bp的PCR产物，那么该乳酸菌具有精氨酸脱亚胺酶途径，否则该乳酸菌不具有精氨酸脱亚胺酶途径；其中引物对A由核苷酸序列为SEQ ID NO.1和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的核苷酸片段组成，或者是由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸片段组成；所述引物对B由核苷酸序列为SEQ ID NO.3和核苷酸序列为SEQ ID NO.4的核苷酸片段组成，或者是由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸片段组成。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测乳酸菌精氨酸脱亚胺酶途径的方法，其特征在于，所述方法是以乳酸菌基因组DNA为模板，分别用引物对A和引物对B进行PCR，如果能够得到分别为200～300bp、450bp～550bp的PCR产物，那么该乳酸菌具有精氨酸脱亚胺酶途径，否则该乳酸菌不具有精氨酸脱亚胺酶途径；其中引物对A由核苷酸序列为SEQIDNO.1和核苷酸序列为SEQIDNO.2的核苷酸片段组成，或者是由SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸片段组成；所述引物对B由核苷酸序列为SEQIDNO.3和核苷酸序列为SEQIDNO.4的核苷酸片段组成，或者是由SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸片段组成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌包括乳酸乳球菌、弯曲乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、乳杆菌、短乳杆菌、魏斯氏菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、棒状乳杆菌、柠檬明串珠菌、假肠膜明串珠菌、肠膜明串珠菌。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述200～300bp具体是指250bp；所述用450bp～550bp具体是指500bp。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为：DNA模板<500ng，上...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓敏，禹伟，陆健，蔡国林，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32