基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于基因检测领域，特别涉及一种基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及方法。本发明专利技术具体公开了如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：200所示的检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR引物、含有上述引物的试剂盒及运用上述引物或试剂盒用一次PCR扩增反应捕获和扩增乳腺癌/卵巢癌易感基因的检测方法。本发明专利技术的多重PCR引物、试剂盒和检测方法，能够同时检测多个样本多个乳腺癌/卵巢癌易感基因，有效提高检测效率、准确率，同时降低了成本、简化了操作步骤。

Multiplex PCR specific primers, kits and methods for detecting breast cancer / ovarian cancer susceptibility genes based on high throughput sequencing technology

The present invention belongs to the field of gene testing, in particular to a multiplex PCR specific primer, kit and method for detecting breast cancer / ovarian cancer susceptibility gene based on high throughput sequencing technology. The present invention discloses specific such as SEQ ID NO:1 to SEQ ID NO:200 shown in detection of breast / ovarian cancer susceptibility gene by multiplex PCR primer, containing the primer kit and using the primer or kit with a PCR amplification reaction capture and amplification of breast / ovarian cancer susceptibility gene because of the detection method. The invention of the multiplex PCR primer, kit and detection method, can simultaneously detect multiple samples of multiple breast / ovarian cancer susceptibility gene, effectively improve the detection efficiency and accuracy, and reduce the cost and simplify the operation steps.

【技术实现步骤摘要】
基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及方法
本专利技术属于基因检测领域，特别涉及一种基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
乳腺癌是影响妇女健康的最常见恶性肿瘤之一，已经成为女性疾病的第一杀手，发病率逐渐攀升，并逐渐呈现年轻化的趋势，预计到2030年，我国女性乳腺癌发病率将比2008年上升至31％。同时，乳腺癌有明显的家族遗传倾向，基因突变携带者的乳腺癌发病风险远高于一般人群。卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，发病隐匿，早期诊断困难，除遗传性卵巢癌外，没有一级防护措施。易感基因是指和特定疾病具有一定关联的基因或等位基因。对乳腺癌/卵巢癌的易感基因及其突变位点进行测序，可得到具体的基因序列信息，进而评估乳腺癌/卵巢癌的遗传风险，可以做到早预防、早控制，降低疾病发生几率，提高广大女性健康水平。大量研究表明，遗传因素在疾病的易感性中发挥重要作用，复杂疾病的遗传因素通过微效基因作用的累加可以形成明显的表型综合效应。因此对乳腺癌卵巢癌的多个易感基因的遗传性突变，包括点突变、短片段插入、缺失等进行检测，并利用生物信息学方法对其进行分析注释，评估该测试个体是否为高风险人群至关重要。目前，检测乳腺癌/卵巢癌易感基因常见方法有Sanger法、基因芯片法、荧光定量PCR法、高通量测序法等。Sanger测序法测序每次只能对一个样品的某一段区域进行测序，检测效率低、成本高，且灵敏度低(20％)。基因芯片法、荧光定量PCR法检测乳腺癌/卵巢癌易感基因，该方法只能针对一个或数个已知突变的位点设计检测探针形成检测芯片，因此无法用于检测未知突变位点，检测的结果也就不够全面、准确。高通量测序法主要是由测序仪器提供商提供的测序仪配套文库构建试剂盒，存在试剂盒货期长、规格固定、试验灵活性和准确性不够等不足。一些试剂厂商根据文献中分享报道的实验方法进行建库，但所完成的实验效果参差不齐，测序质量不高。由此可见，现有技术还有待提高。
技术实现思路
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特异性引物、试剂盒和检测方法，能够同时检测多个样本多个乳腺癌/卵巢癌易感基因，且有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤等。为达到本专利技术目的，采用以下技术方案：一种基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特异性引物，包括100对特异性引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：1至SEQIDNO：200所示。进一步的，所述特异性引物为经过修饰的引物。进一步的，所述特异性引物的修饰方法为硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰中的一种或几种。进一步的，所述特异性引物的Tm值为58-62℃。一种基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的试剂盒，包括上述引物中的至少两对。进一步的，所述试剂盒还包括通用引物、酶混合物、质控品、无核酸酶水；所述酶混合物包括：高保真DNA聚合酶、PCRBuffer、dNTP混合物等。进一步的，所述质控品为人正常基因组DNA。进一步的，所述特异性引物3’端和5’端分别标记Tag1和Tag2。进一步的，所述特异性引物3’端Tag1序列与待测样本目标区域完全互补或部分互补；特异性引物5’端Tag2与通用引物完全互补或部分互补。进一步的，所述通用引物用于对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再次扩增，对不同待测样品的目标区域扩增产物进行连接和标记。进一步的，所述通用引物3’端标记有Tag3；Tag3与特异引物Tag2完全互补或部分互补，长度为50-70bp。进一步的所述特异性引物或所述试剂盒应用于乳腺癌/卵巢癌易感基因检测。基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的方法，包括以下步骤：S1：使用磁珠法对样本进行核酸提取，然后将所提取的样本核酸进行浓度及纯度的测定，测定合格后进行定量稀释，备用；S2：用所述特异性引物或所述试剂盒对S1中所提取的核酸的目标区域进行一次PCR扩增，收集扩增产物备用；S3：使用磁珠法对S2中扩增产物进行核酸纯化，进行浓度及纯度的测定，然后混样，定量，上机测序。进一步的，所述PCR扩增反应体系为：所述酶混合物包括：高保真DNA聚合酶、PCRBuffer、dNTP混合物等。进一步的，所述PCR扩增反应程序为：98℃，激活20min；循环1次；72℃，延伸10min；循环1次。进一步的，所述步骤S1中样本核酸包括乳腺癌/卵巢癌易感基因FGFR2、BRCA1、BRCA2、PALB2、GSTM1、MTHFR、GSTM1或TGF-β1中的至少一种。进一步的，所述步骤S1中样本核酸包括乳腺癌/卵巢癌易感基因BRCA1(引物序列SEQIDNO:1-SEQIDNO:86)、BRCA2(引物序列SEQIDNO:87-SEQIDNO:200)。进一步的，步骤(2)中所述核酸的目标区域，它们可来源于同一个乳腺癌/卵巢癌易感基因，也可来源于不同的乳腺癌/卵巢癌易感基因；包括但不限于乳腺癌/卵巢癌易感基因上的内部序列、基因的外部调控序列；所述基因内部序列，包括但不限于基因的内含子区域、外显子区域、同时含有内含子与外显子的区域。进一步的，所述检测方法的检测样本包括离体的全血样品、口腔脱落细胞样品、组织样品等；所述组织样品包括石蜡包埋组织、新鲜组织和冰冻切片等。上述高通量测序平台包含但不限于IlluminaHiSeq/MiSeq、LifeIonTorrent/Proton平台、华大基因BGISEQ-500/50等测序平台。本专利技术有益效果：本专利技术提供的特异性引物是针对乳腺癌/卵巢癌易感基因的全外显子设计的引物，结构稳定，覆盖范围广、检测位点多。每对特异性引物扩增目标区域大小为450-550bp，所有引物Tm值统一设计为58-62℃。本专利技术提供的多重PCR引物设计时引进特异性修饰，比如硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰等修饰方法，修饰后的引物不易被核酸酶降解，确保PCR扩增特异性的同时保证其扩增效率；且具有相对均一的Tm值，在多重扩增时表现出很好的特异性、稳定性及均一性，同时不存在非特异扩增，此方法省去多轮引物筛选的工作。具体的，硫代修饰后的引物序列寡核苷酸链上带双键的氧原子被硫原子取代的衍生物，能够抵抗核酸酶的降解，增强引物稳定性；脱氧尿嘧啶修饰后的引物寡核苷酸序列中每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧尿嘧啶替代，可以使双链溶解温度增长1.7℃，从而增加双链的稳定性；5’反向dT修饰后的引物寡核苷酸序列5’末端含有反向dT，从而形成交联，形成的交联可以抑制在DNA聚合酶延伸过程中的外切核酸酶的降解作用。本专利技术自主研发的基于高通量测序技术的针对乳腺癌/卵巢癌发病率较高的易感基因的多重PCR特异性引物、试剂盒和检测方法，能够用一次PCR扩增反应捕获和扩增多个样本多个乳腺癌/卵巢癌易感基因，包括点突变、短片段插入缺失等遗传性突变，有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤、灵活提供试剂盒包装规格等。本专利技术利用高通量基因测序技术突破传统检测技术的限制，提高检测灵敏度；同时还能检测包括已知突变和未知突变位点的变异情况，得到全面准确的检测结果。通过对乳腺癌/卵巢癌的易感基因及其突变位点进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特异性引物，其特征在于，所述多重PCR特异性引物包括100对特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：200所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特异性引物，其特征在于，所述多重PCR特异性引物包括100对特异性引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：1至SEQIDNO：200所示。2.根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，所述引物为经过修饰的引物。3.根据权利要求2所述的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的修饰方法为硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰或5’反向dT修饰中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的Tm值为58-62℃。5.根据权利要求1-4任意一项所述的特异性引物，其特征在于，所述引物应用于乳腺癌/卵巢癌易感基因检测。6.一种基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的试剂盒，其特征在于，包括上述权利要求1-4任意一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱奇，朱瑞娟，关媛妹，罗李江，刘丽，
申请(专利权)人：广州奇辉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44