一种大麦亚端粒寡核苷酸探针及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种大麦亚端粒寡核苷酸探针及其应用，本发明专利技术所述的大麦亚端粒寡核苷酸探针为Oligo‑HvT01，其核苷酸是由一段52bp长的碱基构成，对该核苷酸进行荧光标记可用于构建探针。利用该寡核苷酸探针Oligo‑HvT01进行染色体原位杂交试验能够快速准确地标记大麦染色体亚端粒区域，从而确定大麦染色体亚端粒区域形态。本方法能够准确地确定大麦染色体亚端粒区域形态，方便判断大麦染色体亚端粒区域染色体行为，在大麦分子细胞学领域具有良好的应用前景。

Barley sub telomere oligonucleotide probe and its application

The invention provides a subtelomeric oligonucleotide probe and its application in barley, barley subtelomeric oligonucleotide probe of the invention is Oligo HvT01, the nucleotide is composed of a 52bp long base, fluorescent labeling of the nucleotide probe can be used to build. Using the Oligo oligonucleotide probe HvT01 chromosome in situ hybridization test can quickly and accurately labeled barley chromosome subtelomeric regions, so as to determine the barley chromosome subtelomeric region form. The method can accurately determine the shape of the sub telomere region of barley chromosome, and is convenient for judging the chromosomal behavior in the chromosome sub telomere region of barley, and has a good application prospect in the field of barley molecular cytology.

【技术实现步骤摘要】
一种大麦亚端粒寡核苷酸探针及其应用
本专利技术涉及分子细胞遗传学领域，特别是涉及大麦染色体原位杂交(FISH)过程中亚端粒的标记，具体地是能够快速、有效地标记大麦亚端粒区域的寡核苷酸探针Oligo-HvT01。
技术介绍
高等生物染色体序列复杂多样，在不同区间存在大量的重复序列，这为标记与鉴定染色体提供了新的思路与方法。在分子细胞遗传学领域，可通过构建重复序列探针对染色体进行标记，分析染色体上探针信号的分布状态，从而区分基因组与染色体组。此外，通过比较染色体上探针信号的变化亦是分析染色体行为的普遍做法。目前，已经报道的大麦亚端粒探针仅有HvT01，其是通过扩增大麦基因组亚端粒重复序列而得到的(Schubertetal.ThePlantJournal1998,14:494)。然而，通过标记扩增产物制作FISH探针流程复杂，耗时费力，且受多种因素影响使得标记效果往往不理想。尤其是在进行大量试验操作时，这一方法将在很大程度上影响试验进程与效果。
技术实现思路
为克服现有技术的上述不足，本专利技术提供一种能稳定标记大麦亚端粒区域的核苷酸探针以及该探针在原位杂交中检测大麦材料亚端粒区域中的应用。基于以上目的，本专利技术根据Schubertetal.(ThePlantJournal1998,14:494)对大麦染色体亚端粒区的研究结果确定的引物，上游引物序列，5’-CGAAACTCGCATTTTGGCC-3’(HvT01-F)下游引物序列，5’-AGAGTTCCCGTAACCGGCCC-3’(HvT01-R)，利用该引物对栽培大麦Baudin、野生大麦CN4027全基因组DNA进行PCR扩增反应，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，发现其产物存在如图1所示的4条较亮条带。选取其250bp左右条带回收并构建质粒进行测序，结果显示，其序列长度为113-116bp，说明所回收的核苷酸中存在两个前后相连的相似性极高的片段。利用DNAMAN5.0软件对测序结果进行序列比对分析，并从其3’端选取出一段相对保守的全长为52bp的核苷酸用于探针制备，其碱基序列为：5’-CCGCTGCGATCCAAACGTTTCGGGAACCCCGGGGGCCGGTTACGGGAACTCT-3’，将其命名为Oligo-HvT01，合成该序列并对其进行荧光标记物质标记用于制作探针。本专利技术提供了上述寡核苷酸探针在大麦荧光原位杂交中的应用。本专利技术的寡核苷酸探针可用于检测大麦材料染色体亚端粒区域。本专利技术提供了上述寡核苷酸探针在检测大麦材料染色体亚端粒区域的应用，是用上述寡核苷酸探针对大麦染色体开展荧光原位杂交试验，若在荧光显微镜下大麦染色体亚端粒区域检测出信号，说明寡核苷酸探针Oligo-HvT01能用于标记大麦染色体亚端粒区域，为一种新的大麦亚端粒区域探针。本专利技术提供了检测大麦材料染色体亚端粒区域的寡核苷酸探针，即Oligo-HvT01，探针核苷酸序列为：5’-CCGCTGCGATCCAAACGTTTCGGGAACCCCGGGGGCCGGTTACGGGAACTCT-3’。(SEQIDNO.3)进一步地，提供了Oligo-HvT01在检测大麦材料染色体亚端粒区域的应用。本专利技术提供了Oligo-HvT01探针在鉴定大麦染色体亚端粒区域形态中的应用。本专利技术提供了Oligo-HvT01探针在大麦荧光原位杂交中的应用。本专利技术提供了Oligo-HvT01探针在大麦种质资源改良中的应用。本专利技术提供了一种检测大麦材料染色体亚端粒区域的检测方法，用寡核苷酸探针Oligo-HvT01对大麦材料染色体开展荧光原位杂交试验，若在荧光显微镜下大麦染色体亚端粒区域检测出信号，说明寡核苷酸探针Oligo-HvT01能用于标记大麦染色体亚端粒区域。其中，所述荧光原位杂交方法反应程序为：于光学显微镜下检查染色体，选取染色体形态清晰、分散较好的载玻片，变性处理后脱水晾干，滴加混合杂交液于载玻片上，盖盖玻片，置于潮湿的黑暗中孵育，清洗，滴加染液盖盖玻片，于荧光显微镜下观察染色体。具体地反应程序为：于光学显微镜下检查染色体，选取染色体形态清晰、分散较好的载玻片，滴加70μl70％甲酰胺变性剂，盖盖玻片于80℃下变性2min，迅速甩掉盖玻片于-20℃下70％、95％、99％酒精梯度脱水，每梯度脱水5min，取出后自然晾干。滴加10μl(0.35μl1OD/mlOligo-HvT01探针与9.65μl杂交液)混合杂交液于晾干的载玻片上，盖盖玻片，置于潮湿的暗盒中37℃孵育2h，2×SSC缓冲液清洗杂交液两次，ddH2O洗1次，滴加10μlDAPI染液，盖盖玻片，于OLYMPUSBX63DP80荧光显微镜下观察染色体并使用OLYMPUSDP80CCD相机拍摄照片。上述杂交液为：5mMTris-HCl,0.5mMEDTA,0.15MNaCl,0.015M柠檬酸钠。在本专利技术的实施例中，采用羟基荧光素(FAM)标记本专利技术的寡核苷酸探针，利用该探针对大麦材料染色体开展荧光原位杂交试验，若在荧光显微镜下大麦染色体亚端粒区域出现绿色信号，说明寡核苷酸探针Oligo-HvT01能用于标记大麦染色体亚端粒区域。本专利技术提供了上述方法在大麦细胞学中的应用。本专利技术所开发的大麦染色体亚端粒区域寡核苷酸探针，可直接对大麦染色体亚端粒区域进行检测。该方法不仅具有灵敏度高、检测效果好的特点，同时还克服了传统的质粒标记方法所带来的流程复杂、标记效果受干扰较大的不足，这就检测大麦染色体亚端粒区域而言是一种很好的探针。利用本专利技术的鉴定方法，将使后续研究操作更加便捷有效。附图说明图1为栽培大麦Baudin、野生大麦CN4027PCR扩增凝胶电泳检测图，从左到右依次为Marker、Baudin、CN4027。图中从100bp-500bp间存在4条较亮条带，250bp左右条带为回收条带。图2为栽培大麦Baudin、野生大麦CN4027扩增序列对比结果。各材料从涂板中选取24株长势较好菌落涂板，再从涂板中挑选3条菌落条带测序，Baudin1、Baudin9、Baudin21分别表示材料Baudin第1、9、21条菌落条带，CN402711、CN402717、CN402719分别表示材料CN4027第11、17、19条菌落条带。图3为寡合苷酸序列探针Oligo-HvT01在栽培大麦Baudin(左)、野生大麦CN4027(右)染色体上的标记效果图，其中灰色区域为DAPI标记的大麦染色体，亚端粒高亮区域为Oligo-HvT01信号点。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本专利技术所使用的大麦材料：栽培品种Baudin、野生品种CN4027，均来自四川农业大学资源学院。本专利技术所使用生化试剂均为市售。本专利技术各试剂及配方如下：DNA提取试剂盒：TaKaRaMiniBESTPlantDNAExtractionKit(TaKaRa)。PCR扩增试剂盒：EmeraldAmpMAXPCRMasterMix(TaK本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测大麦染色体亚端粒区域的寡核苷酸探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.用于检测大麦染色体亚端粒区域的寡核苷酸探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。2.如权利要求1所述的寡核苷酸探针，其特征在于，用荧光标记物标记该寡核苷酸探针。3.权利要求1或2所述的寡核苷酸探针在检测大麦染色体亚端粒区域中的应用。4.权利要求1或2所述的寡核苷酸探针在鉴定大麦染色体亚端粒区域形态中的应用。5.权利要求1或2所述的寡核苷酸探针在大麦荧光原位杂交中的应用。6.权利要求1或2所述的寡核苷酸探针在大麦种质资源改良中的应用。7.一种检测大麦染色体亚端粒区域的方法，其特征在于，利用权利要求2所述的寡核苷酸探针对大...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈光登，胡德益，康亮珠，李廷轩，张锡洲，余海英，刘涛，王永东，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51