一种通用荧光探针及其检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及实时荧光PCR领域，尤其涉及一种通用荧光探针及其检测方法和应用；通用荧光探针包括正链探针、负链探针以及特异性下游引物；正链探针包括由5’端至3’端依次相连的寡聚核苷酸正链序列、连接序列和特异性上游引物序列；负链探针包括与寡聚核苷酸正链序列互补的寡聚核苷酸负链序列，寡聚核苷酸负链序列的5’端和3’端分别连接有荧光基团和淬灭基团；特异性上游引物序列和特异性下游引物与目标基因的靶点序列相互互补；检测方法为采用通用荧光探针进行荧光PCR扩增；通用荧光探针可用于基因分型和突变基因检测；本发明专利技术的通用荧光探针及其检测方法和应用，实现实时检测、无需PCR后续处理、节省设计和合成时间、降低成本、结果稳定性好且易于分析。

Universal fluorescent probe and detection method and application thereof

The invention relates to a real-time fluorescent PCR field, especially relates to a universal fluorescent probe and its detection method and application; general fluorescent probes including positive strand probe, negative strand probe and specific primers; positive strand probe consists of 5 'to 3' end connected oligonucleotide chain is connected sequence, sequence and specific primers sequence; negative strand oligonucleotide probe including positive strand oligonucleotide sequences complementary negative strand oligonucleotide sequence, negative sequence chain 5 'and 3' ends are respectively connected with a fluorophore and quencher; target sequence specific primers and sequence specific primer and downstream target gene complement; detection method for fluorescent PCR amplification using universal fluorescent probe; universal fluorescent probe can be used for genotyping and gene mutation; general fluorescent probe of the invention and The detection method and application of the invention can realize real-time detection, no need of PCR follow-up processing, saving design and synthesis time, reducing cost, good stability of results and easy analysis.

【技术实现步骤摘要】
一种通用荧光探针及其检测方法和应用
本专利技术涉及实时荧光PCR领域，尤其涉及一种通用荧光探针及其检测方法和应用。
技术介绍
现有技术中，荧光素标记方法在PCR中的应用，主要体现在荧光引物或荧光探针两个方面。其中，荧光引物的方法，主要有直接标记引物或者标记接头引物，而PCR产物采用遗传分析仪，如ABI遗传分析仪310、3130、3130xl、3730等，通常用于检测微卫星及基因分型，例如中国专利公告号为CN104178566的专利技术专利，即公开了一种可用于微卫星检测的多重荧光PCR通用接头及检测方法和应用，其引物设计图和检测流程图分别如图1和图2所示。该技术的缺点包括：a)不能实现实时检测；b)图谱结果分析难，易误判；c)PCR产物需后处理，易污染检测环境。荧光探针又可分为水解探针和杂交探针，其荧光信号检测主要通过实时荧光定量PCR仪进行。其中，1)水解探针：如图3所示，以TaqMan探针为例进行说明，水解探针的5'端和3'端分别标记了一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，在探针完整时，系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号；而当PCR过程中TaqDNA聚合酶扩增到探针结合模版的位点时，其5'-3'核酸外切酶的活性切割掉探针5'端的报告基团——游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到，检测的是信号的积累。这种TaqMan探针技术，需要针对目的基因或突变位点设计特异性探针，不同基因或突变位点需重新设计、合成，存在成本高且费时的问题。2)杂交探针，复性时两条特异探针杂交到模板上，相互靠近而产生检测信号，到升温变性探针远离模板，无信号，检测的是实时荧光信号。分子信标(Molecularbeacon，MB)是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近，在复性温度下，模板不存在时，形成茎环结构，当加热变性会使互补配对的茎环双链解开，如图4所示，如果有模板存在环序列，分子信标将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，淬灭作用被解除，发出激发光子。这种分子信标技术，需要针对目的基因或突变位点设计特异性探针，不同基因或突变位点需重新设计、合成，存在成本高且费时的问题；另外需通过熔解曲线Tm峰值进行检测，检测灵敏度有限。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种实现实时检测、无需PCR后续处理、节省设计和合成时间、降低成本、结果稳定性好且易于分析的通用荧光探针及其检测方法和应用。本专利技术第一方面提供一种通用荧光探针，包括正链探针、负链探针以及特异性下游引物；其中，所述正链探针包括由5’端至3’端依次相连的寡聚核苷酸正链序列(UAP)、连接序列和特异性上游引物序列(ASO)；所述负链探针包括与寡聚核苷酸正链序列互补的寡聚核苷酸负链序列，所述寡聚核苷酸负链序列的5’端和3’端分别连接有荧光基团(R)和淬灭基团(Q)；所述特异性上游引物序列(ASO)和特异性下游引物(LSO)与目标基因的靶点序列相互互补。进一步的，所述连接序列包括TABox序列，所述TABox序列为包括但不限于AA、TT、AAA、TTT、AT、TA、ATA、TAT、AAT、TAA、ATTT、TAAA、TATT、AATA、TTAT、TATA、ATAT、ATATA、TATATA、TTTAA、TATTT、TTATT、TTTAT、TAATT、TTAAT、AAATT、ATAAA、AATAA或AAATA的序列。应当说明的是，为了实现通用荧光探针在某一类目的生物中的通用检测，所述寡聚核苷酸正链序列与采用该通用荧光探针进行检测的目的生物的序列相比无同源性或序列相似度小于30％。应当说明的是，同源性是指进化过程中源于同一祖先的分支之间的关系，同源性是来描述物种之间的进化关系的，所谓同源序列，是指从某一共同祖先经趋异进化而形成的不同序列。相似性是指序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低。一般认为，序列之间的相似性(similarity)越高，序列之间同源的可能性越大。当相似程度高于50％时，比较容易推测检测序列和目标序列可能是同源序列；而当相似性程度低于20％时，就难以确定或者根本无法确定两者具有同源性。关于通用荧光探针的设计，若目的生物为真核生物，则所述寡聚核苷酸正链序列可根据酵母菌基因组序列设计而成。进一步的，所述寡聚核苷酸正链序列采用如SEQIDNO：1-6中任一项所示的核苷酸序列，相应的，所述寡聚核苷酸负链序列采用如SEQIDNO：7-12中所示的核苷酸序列。其序列信息具体如下：GCGTGTTGAGTGTGCGGCGTAGA(SEQIDNO：1)GCGAAAGCCTGACGGAGCGAG(SEQIDNO：2)AGATGTAGCGATAGCCTGAGCGAGCGA(SEQIDNO：3)GATGAGTGTGTTGCGGCGTAGATGAGTG(SEQIDNO：4)TAGCGATAGCCTGAGCGAGCGA(SEQIDNO：5)GCGATGCGTGACGGAGAGTGAG(SEQIDNO：6)R-TCTACGCCGCACACTCAACACGC-Q(SEQIDNO：7)R-CTCGCTCCGTCAGGCTTTCGC-Q(SEQIDNO：8)R-TCGCTCGCTCAGGCTATCGCTACATCT-Q(SEQIDNO：9)R-CACTCATCTACGCCGCAACACACTCATC-Q(SEQIDNO：10)R-TCGCTCGCTCAGGCTATCGCTA-Q(SEQIDNO：11)R-CTCACTCTCCGTCACGCATCGC-Q(SEQIDNO：12)其中，R代表荧光基团，Q代表淬灭基团。进一步的，所述荧光基团包括但不限于FAM、TET、TexasRed、VIC或Cy5，所述淬灭基团包括但不限于BHQ1或BHQ2。本专利技术第二方面提供一种采用前述通用荧光探针的检测方法，包括以下步骤：S1、提取样品的基因组DNA；S2、将通用荧光探针中正链探针、负链探针以及特异性下游引物按一定比例混合；S3、配制PCR反应体系，进行实时荧光PCR扩增；S4、根据实时检测的荧光信号强度进行结果分析。应当说明的是，对于低丰度目标样品或者低回收率的核酸样本，在步骤S1之后还包括采用上游引物(FP)和下游引物(RP)对样品的基因组DNA预扩增的步骤，然后再将通用荧光探针中正链探针、负链探针以及特异性下游引物按一定比例混合，然后进行PCR扩增；对于高丰度目标样品或者高回收率的核酸样本，可以直接将通用荧光探针中正链探针、负链探针以及特异性下游引物按一定比例混合，然后进行PCR扩增。进一步的，所述上游引物和下游引物、以及通用荧光探针均设置为多组以同时检测多个目标基因，或者，所述通用荧光探针设置为多组以检测多个目标基因、或单个目标基因的多个基因型。本专利技术第三方面提供一种前述通用荧光探针，在基因分型和突变基因检测上的应用。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：1)通用荧光探针序列特异，通用性较高；2)通用荧光探针可用于SNP位点本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通用荧光探针，其特征在于：包括正链探针、负链探针以及特异性下游引物；其中，所述正链探针包括由5’端至3’端依次相连的寡聚核苷酸正链序列、连接序列和特异性上游引物序列；所述负链探针包括与寡聚核苷酸正链序列互补的寡聚核苷酸负链序列，所述寡聚核苷酸负链序列的5’端和3’端分别连接有荧光基团和淬灭基团；所述特异性上游引物序列和特异性下游引物与目标基因的靶点序列相互互补。

【技术特征摘要】
1.一种通用荧光探针，其特征在于：包括正链探针、负链探针以及特异性下游引物；其中，所述正链探针包括由5’端至3’端依次相连的寡聚核苷酸正链序列、连接序列和特异性上游引物序列；所述负链探针包括与寡聚核苷酸正链序列互补的寡聚核苷酸负链序列，所述寡聚核苷酸负链序列的5’端和3’端分别连接有荧光基团和淬灭基团；所述特异性上游引物序列和特异性下游引物与目标基因的靶点序列相互互补。2.根据权利要求1所述的通用荧光探针，其特征在于：所述连接序列包括TABox序列，所述TABox序列为包括但不限于AA、TT、AAA、TTT、AT、TA、ATA、TAT、AAT、TAA、ATTT、TAAA、TATT、AATA、TTAT、TATA、ATAT、ATATA、TATATA、TTTAA、TATTT、TTATT、TTTAT、TAATT、TTAAT、AAATT、ATAAA、AATAA或AAATA的序列。3.根据权利要求1所述的通用荧光探针，其特征在于：所述寡聚核苷酸正链序列与采用该通用荧光探针进行检测的目的生物的序列相比无同源性或序列相似度小于30％。4.根据权利要求3所述的通用荧光探针，其特征在于：所述目的生物为真核生物，所述寡聚核苷酸正链序列根据酵母菌基因组序列设计而成。5.根据权利要求1所述的通用荧光探针，其特征在于：所述寡聚核苷酸正链序列采用如SEQIDNO：1-6中任一项所示的核苷酸序列，所述寡聚核...

【专利技术属性】
技术研发人员：周立新，叶绍云，白永飞，李丹，杨小娟，蒋峻峰，
申请(专利权)人：健路生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32