HER‑2阳性乳腺癌组织的标志物miR‑126‑3p、应用及其诊断试剂盒制造技术

本申请公开了一种可用于预示和诊断HER‑2阳性乳腺癌组织的标志物miR‑126‑3p、该标志物的应用以及诊断试剂盒。本申请表明miR‑126‑3p可以作为HER‑2阳性乳腺癌的治疗靶点。诊断试剂盒包括：MiR‑126‑3p的核酸探针、阴性对照Scramble的核酸探针、阳性对照U6snRNA的核酸探针、原位杂交缓冲液和蛋白酶K粉末。使用本发明专利技术的乳腺癌分子标志物miR‑126‑3p诊断HER‑2阳性乳腺癌具有操作简单，取材方便、安全无创伤、高特异性、高精确性的特点。

HER 2 positive breast cancer marker miR 126 3P, application and diagnostic kit

The invention discloses an application can be used for prediction and diagnosis of HER 2 positive breast cancer marker miR 126 3P, the markers and diagnostic kit. This application shows that miR can be used as HER 3P 126 2 positive breast cancer therapeutic target. Diagnostic kit includes: nucleic acid probe, negative MiR 126 3P control nucleic acid probe, Scramble positive control of U6snRNA nucleic acid probe, in situ hybridization buffer and proteinase K powder. The invention of the breast cancer molecular marker miR 126 3P 2 diagnosis of HER positive breast cancer has the advantages of simple operation, convenient, safe and non-invasive characteristics, high specificity, high accuracy.

【技术实现步骤摘要】
HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p、应用及其诊断试剂盒
本专利技术涉及生物医学
，具体地说，是涉及一种可用于预示和诊断HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p、该标志物的应用以及诊断试剂盒。
技术介绍
乳腺癌是世界上女性人口中最常见的恶性肿瘤，也是女性癌症死亡的最常见原因之一。乳腺癌是一组异质性疾病，包括多种病理类型，每种病理类型均具有不同的组织学表现、不同的生物学行为、不同的临床表现，不同的治疗反应和治疗结果。Perou等首次采用基因微阵列及预后聚类分析技术对乳腺癌标本进行测定，发现不同的乳腺癌基因表型与其临床生物学行为及预后关系密切。根据其遗传和分子图谱，采用表达谱芯片技术可以将浸润性乳腺癌分为5类：分别为LuminalA型(ER和/或PR+、HER-2-、Ki-67<l4％)、LuminalB型(ER和/或PR+、HER-2-、Ki-67≥14％；ER和/或PR+、HER-2+、Ki67任何水平)、HER-2过表达型(ER-、PR-、HER-2+)和三阴型(triple-negativebreastcarcinomas,TNBCs)(ER-、PR-、HER-2-)。其中激素治疗对ER(+)类型有效，曲妥单抗治疗对HER-2过表达型有效。TNBC类型约占乳腺癌发病总数的15％-20％，且因其激素受体位点三联阴性，对抗激素治疗及赫赛汀治疗无效，唯一的治疗方案为系统性化疗。因此4种不同免疫表型的乳腺癌具有相对独立的生物学行为和临床预后，研究各亚型相应的病理特征对于提供新的乳腺癌个体化治疗方法，实现精准医疗具有重要意义。MicroRNA(miRNA)是长度约18-25nt的非蛋白编码小分子RNA，广泛存在于各种真核细胞生物细胞中。近年来大量研究表明miRNAs对人类肿瘤的发生、发展起着重要的作用，并扮演着致癌基因和抑癌基因的角色。近年研究已经在乳腺癌组织中发现了一系列异常表达的miRNAs。其中miR-126-3p被发现在转移性乳腺癌细胞系中显著低表达，并被证明在抑制肿瘤转移中发挥关键作用。但是，迄今为止缺乏乳腺癌组织学证据表明miR-126-3p在不同免疫表型的乳腺癌中表达是否存在差异。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是能够表达HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p、该标志物在制备诊断HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂中的应用及其诊断试剂盒。本申请表明miR-126-3p可以作为特定分子亚型乳腺癌的治疗靶点。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂盒，包括：MiR-126-3p的核酸探针、阴性对照Scramble的核酸探针、阳性对照U6snRNA的核酸探针、原位杂交缓冲液和蛋白酶K粉末。优选地，所述MiR-126-3p的核酸探针序列如SEQIDNO：1所示。优选地，所述阴性对照Scramble的核酸探针序列如SEQIDNO：2所示。优选地，所述阳性对照U6snRNA的核酸探针序列如SEQIDNO：3所示。本申请还公开了HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p在制备诊断HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂中的应用，其特征在于，所述HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p的核酸探针序列如SEQIDNO：1所示。优选地，采用FISH检测方法检测乳腺癌组织中的miR-126-3p含量。优选地，包括步骤：(1)制备MiR-126-3p的核酸探针、阴性对照Scramble的核酸探针和阳性对照U6snRNA的核酸探针；(2)杂交步骤①将组织芯片放入烘箱中，温度调至60-65度，烘蜡1小时；②探针的预处理：准备1×miRNA-ISH缓冲液：10ml2×miRNA-ISH缓冲液和10mlDEPCH2O，将40ul的核酸探针放在无RNA酶的PCR管中，90℃变性4min，放在冰上，快速离心后加入20ml的1×miRNA-ISH缓冲，按1-2ml的体积分装，待使用时直接冻融使用；③缓冲液配制：10×PBS：取40gNaCl，1gKCl，7.2gNa2PO4，1.2gKH2PO4，用HCl调节pH7.4，用DEPC水定容至500ml；1×PBT：取50ml10×PBS和0.5mlTween，用DEPC水定容至500ml；1MTris-HCl，PH7.4：30.475gTris碱，加150mlDEPC水，用浓盐酸调节PH至7.4，用DEPC水定容至250ml；蛋白酶K存储液的配制：用10mMTris-HClPH.7.5稀释蛋白酶K至20mg/ml；顺丁烯二酸缓冲液：0.1M顺丁烯二酸，0.15MNaCl，用NaOH调节PH至7.5；NBT/BCIP稀释液：100ml1M/LTris-HCl，20ml5M/LNaCl，880mlDEPCddH2O，pH9.5；④样本脱蜡：二甲苯3次每次5min，乙醇100％上下浸洗10次，乙醇100％上下浸洗10次乙醇100％5min，乙醇96％上下浸洗10次，乙醇96％5min，乙醇70％上下浸洗10次，乙醇70％5min，PBS2-5min；⑤蛋白酶消化样本：蛋白酶K15ug/mL37℃处理10-30min，PBS2次，简单震摇；⑥酒精脱水：乙醇70％上下浸洗10次乙醇70％1min，乙醇96％上下浸洗10次，乙醇96％1min，乙醇100％上下浸洗10次，乙醇100％1min，放在干净的纸上空气干燥15min；⑦杂交：每张玻片上加50-100ul的杂交液；玻片上盖上22mm×22mm盖玻片，用胶水封片，在杂交温度50℃1h；⑧严格的洗片：用镊子小心的把封片胶撕掉，把玻片放入下面溶液梯度洗片：5×SSC5min杂交温度50℃，1×SSC5min杂交温度50℃，0.2×SSC5min杂交温度50℃，0.2×SSC5min室温，室温，PBS1次×5min；⑨免疫检测：将玻片甩干，在室温湿盒上滴加封闭液，封闭15min；用纸吸干封闭液后，放在湿盒1:800anti-DIG-APFabfragments，4℃过夜；室温，PBST3次×3min；⑩颜色反应和复染封片：避光反应NBT/BCIP30℃显色2h(400ul/玻片)，室温，PBST3次×5min；在水中洗片，2次1min；加200ul核固红染液，10秒-1分钟；将片子在自来水中冲洗10分钟，酒精脱水；用中性树脂封片；(3)原位杂交检测结果判断：通过双盲法独立评估，分别评价其阳性细胞数和染色程度，阳性细胞数评分：未见阳性细胞为0，阳性细胞<5％为1，6％～25％为2，25％～50％为3，51％～75％为4，>75％为5；染色程度评分：未见染色为0，出现浅灰色颗粒为1，出现深灰色为2，出现黑色颗粒为3，总评分结果＝染色阳性细胞数评分×染色程度评分。与现有技术相比，本专利技术所述的HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p、应用及其诊断试剂盒，达到了如下效果：使用本专利技术的乳腺癌分子标志物miR-126-3p诊断HER-2阳性乳腺癌具有操作简单，取材方便、安全无创伤、高特异性、高精确性的特点。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种HER‑2阳性乳腺癌的诊断试剂盒，其特征在于，包括：MiR‑126‑3p的核酸探针、阴性对照Scramble的核酸探针、阳性对照U6snRNA的核酸探针、原位杂交缓冲液和蛋白酶K粉末。

【技术特征摘要】
1.一种HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂盒，其特征在于，包括：MiR-126-3p的核酸探针、阴性对照Scramble的核酸探针、阳性对照U6snRNA的核酸探针、原位杂交缓冲液和蛋白酶K粉末。2.根据权利要求3所述的HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述MiR-126-3p的核酸探针序列如SEQIDNO：1所示。3.根据权利要求3所述的HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述阴性对照Scramble的核酸探针序列如SEQIDNO：2所示。4.根据权利要求3所述的HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述阳性对照U6snRNA的核酸探针序列如SEQIDNO：3所示。5.HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p在制备诊断HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂中的应用，其特征在于，所述HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p的核酸探针序列如SEQIDNO：1所示。6.根据权利要求5所述的HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p在制备诊断HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂中的应用，其特征在于，采用FISH检测方法检测乳腺癌组织中的miR-126-3p含量。7.根据权利要求5所述的HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p在制备诊断HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂中的应用，其特征在于，包括步骤：(1)制备MiR-126-3p的核酸探针、阴性对照Scramble的核酸探针和阳性对照U6snRNA的核酸探针；(2)杂交步骤①将组织芯片放入烘箱中，温度调至60-65度，烘蜡1小时；②探针的预处理：准备1×miRNA-ISH缓冲液：10ml2×miRNA-ISH缓冲液和10mlDEPCH2O，将40ul的核酸探针放在无RNA酶的PCR管中，90℃变性4min，放在冰上，快速离心后加入20ml的1×miRNA-ISH缓冲，按1-2ml的体积分装，待使用时直接冻融使用；③缓冲液配制：10×PBS：取40gNaCl，1gKCl，7.2gNa2PO4，1.2gKH2PO4，用HCl调节pH7.4，用DEPC水定容至500ml；1×PBT：取50ml10×PBS和0.5mlTween，用DEPC水定容至500ml；1MTris-HCl，PH7.4：30.475gTris碱，加150mlDEPC水，用浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丽琴，李静，平金良，黄惠莲，钟婧，戴利成，
申请(专利权)人：湖州市中心医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33