一种酶法转化L‑丙氨酸制备丙酮酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶法转化L‑丙氨酸制备丙酮酸的方法，步骤1、向湿菌体溶液中加入丙烯酰胺单体和交联剂N,N‑甲叉双丙烯酰胺，在加速剂四甲基乙二胺和催化剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状的固定化酶凝胶，进而制取固定化的L‑氨基酸氧化酶；步骤2、以L‑丙氨酸作为反应底物，在上述固定化的L‑氨基酸氧化酶的作用下氧化脱氨得到L‑丙酮酸。本发明专利技术具有成本低廉、纯度高、反应条件温和的优点，适合丙酮酸的工业化生产。

A method of enzymatic conversion of L alanine for the preparation of pyruvic acid

The invention discloses a method for enzymatic conversion of L alanine pyruvate preparation, step 1, wet cell solution adding acrylamide monomer and crosslinking agent N, N bisacrylamide, accelerating agent four methyl ethylenediamine catalyst and ammonium persulfate under the effect of the polymerization of immobilized enzyme into three-dimensional gel net, and L amino acid oxidase immobilized preparation; step 2, to L alanine as a substrate, in the L amino acid oxidase immobilized under the action of the oxidative deamination of L pyruvate. The present invention has the advantages of low cost, high purity and mild reaction condition, and is suitable for the industrial production of pyruvic acid.

【技术实现步骤摘要】
一种酶法转化L-丙氨酸制备丙酮酸的方法
本专利技术属于丙酮酸的制备
，涉及一种酶法转化L-丙氨酸制备丙酮酸的方法。
技术介绍
丙酮酸（焦性葡萄酸）是参与整个生物体基本代谢的中间产物之一。丙酮酸参与生物体的糖代谢、胶质、氨基酸、蛋白质等的生化合成、代谢、醇的发酵等，可以通过乙酰COA和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸之间的相互转化，在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。丙酮酸在生产领域具有重要的作用，是生产色氨酸、苯丙氨酸和维生素B的主要原料，也是合成L-多巴的原料，在有机合成和生化研究领域具有重要作用。目前中国主要依赖进口丙酮酸类产品，市场上主要采用的是发酵法、化学合成法、酶转化法。日本在生产左旋丙酮酸方面处于国际领先地位，主要采用的是生物发酵的方法，但发酵法制取丙酮酸转化率往往较低，因为丙酮酸在糖代谢中处于最活跃的中心节点，在细胞中很容易转化为其他化合物,因此很难累积，而且，丙酮酸作为发酵产物混合物的一种成分，往往是相当低浓度的，从复杂的发酵液中分离提取丙酮酸，一般是难以进行的，费用也较昂贵。化学合成的方法主要采用乳酸氧化法，以乳酸为原料，氧化脱氢一步法生产丙酮酸。但乳酸直接制取丙酮酸非常困难,根据工艺不同必须选用合适的催化剂。可以选择的催化剂有磷酸铁、钼酸碲盐、银、钒等。但缺点是成本较高，约6万元每吨。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对上述存在的缺陷而提供一种酶法转化L-丙氨酸制备丙酮酸的方法，具有成本低廉、纯度高、无污染的优点。本专利技术采用酶法转化L-丙氨酸制备丙酮酸的方法，利用固定化的L-氨基酸氧化酶转化L-丙氨酸制备丙酮酸。本专利技术的利用酶法转化L-丙氨酸制备丙酮酸的方法，其详细步骤为：步骤1、向湿菌体溶液中加入丙烯酰胺单体和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺，在加速剂四甲基乙二胺和催化剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状的固定化酶凝胶，进而制取固定化的L-氨基酸氧化酶；步骤2、以L-丙氨酸作为反应底物，在上述固定化的L-氨基酸氧化酶的作用下氧化脱氨得到L-丙酮酸。湿菌体为含有L-氨基酸氧化酶的大肠杆菌体。湿菌体溶液为湿菌体硅油-水溶液硅油-水溶液的浓度为80%。步骤1中，制取湿菌体溶液的方法为：将湿菌体均匀的分散在硅油-水溶液中，在超声波细胞破碎机进行低温破碎，过滤去除菌体残片，即得到湿菌体溶液。步骤1中，所述丙烯酰胺单体加入量为所述湿菌体溶液重量的200%-600%，所述交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺加入量为湿菌体溶液重量的2.5%-5%，所述加速剂四甲基乙二胺加入量为湿菌体溶液重量的5%-8%，所述催化剂过硫酸铵的加入量为湿菌体溶液重量的2%-5%。步骤1中，将三维网状的固定化酶凝胶搅拌均匀，用水洗涤凝胶，过滤后得固体，即为固定化的L-氨基酸氧化酶。步骤2中，氧化脱氨时，控制反应温度、溶氧量、调节pH，所述控制反应温度为25℃-35℃，所述pH为6.0-7.5，所述溶氧量为410-450mg/L。本专利技术具有以下特点：（1）固定化酶催化的最适反应温度为30℃-35℃；（2）固定化酶催化的最适pH为6.5；（3）极易将固定化酶与底物、产物分开；（4）固定酶的使用效率高，成本降低。本专利技术的有益效果为：本专利技术的酶法转化L-丙氨酸制备丙酮酸的方法，以L-氨基酸为底物，利用制备的固定化酶，进行生物转化，获得产物丙酮酸。固定化酶极易于产物丙酮酸、底物L-氨基酸分开，底物转化率高，杂质少，成本低，生产每吨丙酮酸成本大约1.3万元，反应条件温和，容易控制。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细的说明。实施例1：将湿菌体80g均匀的分散在80%硅油-水溶液100ml中，在750W赫兹的超声波中，低温15℃进行破碎，采用3s-2s-3s的方式进行破碎15分钟，向菌体溶液中加入2倍量的丙烯酰胺单体和2.5%的交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺，在加速剂四甲基乙二胺（加入量5%）和催化剂过硫酸铵（加入量2%）的作用下聚合交联成三维网状的固定化酶凝胶，之后搅拌均匀，用水洗涤凝胶，过滤后得固体，即为固定化酶。将L-丙氨酸89g溶解在纯化水中，配置成8.9%溶液，升温至30℃，向反应液中加入固定化酶19g，酶活774U，控制溶氧410-450mg/L，反应PH在6.0，反应3h后取样，经高效液相检测上清液丙酮酸浓度（80g/L）和L-丙氨酸(≤0.5g/L)剩余，当L-丙氨酸剩余小于等于0.5g/L时，认为反应完全，所得料液降温至室温，过滤去除固定化酶，将料液浓缩至含丙酮酸30%，向料液中加入活性炭10g，搅拌脱色30分钟，脱碳过膜后，继续减压浓缩得无色粘稠液体106g，即为丙酮酸粗品,转化率≥99%，纯度≥98%。实施例2：将湿菌体90g均匀的分散在80%硅油-水溶液100ml中，在800W赫兹的超声波中，低温15℃进行破碎，采用3s-2s-3s的方式进行破碎15分钟，向菌体溶液中加入5倍量的丙烯酰胺单体和4%交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺，在加速剂四甲基乙二胺（加入量6%）和催化剂过硫酸铵（加入量4%）的作用下聚合交联成三维网状的固定化酶凝胶，之后搅拌均匀，用水洗涤凝胶，过滤后得固体，即为固定化酶。将L-丙氨酸95g溶解在纯化水中，配置成9.5%溶液，升温至32℃，向反应液中加入固定化酶22g，酶活879U，控制反应PH在6.5，溶氧410-450mg/L，反应5h取样，经高效液相检测上清液丙酮酸浓度（86g/L）和L-丙氨酸（≤0.5g/L）剩余，当L-丙氨酸剩余小于等于0.5g/L时，认为反应完全，所得料液降温至室温，过滤去除固定化酶，将料液浓缩至含丙酮酸30%，向料液中加入活性炭10g，搅拌脱色30分钟，脱碳过膜后，继续减压浓缩得无色粘稠液体115g，即为丙酮酸粗品，转化率≥99%，纯度≥98%。实施例3：将湿菌体100g均匀的分散在80%硅油-水溶液100ml中，在850W赫兹的超声波中，低温15℃进行破碎，采用3s-2s-3s的方式进行破碎15分钟，向菌体溶液中加入6倍量的丙烯酰胺单体和5%的交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺，在加速剂四甲基乙二胺（加入量8%）和催化剂过硫酸铵(加入量5%)的作用下聚合交联成三维网状的固定化酶凝胶，之后搅拌均匀，用水洗涤凝胶，过滤后得固体，即为固定化酶。将L-丙氨酸100g溶解在纯化水中，配置成10%溶液，升温至35℃，向反应液中加入固定化酶25g，酶活987U，控制反应PH在7.5，溶氧410-450mg/L，反应5h取样，经高效液相检测上清液丙酮酸浓度（92g/L）和L-丙氨酸剩余（≤0.5g/L），当L-丙氨酸剩余小于等于0.5g/L时，认为反应完全，所得料液降温至室温，过滤去除固定化酶，将料液浓缩至含丙酮酸30%，向料液中加入活性炭10g，搅拌脱色30分钟，脱碳过膜后，继续减压浓缩得无色粘稠液体120g，即为丙酮酸粗品，转化率≥99%，纯度≥98%。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶法转化L‑丙氨酸制备丙酮酸的方法，其特征在于：步骤1:向湿菌体溶液中加入丙烯酰胺单体和交联剂N,N‑甲叉双丙烯酰胺，在加速剂四甲基乙二胺和催化剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状的固定化酶凝胶，进而制取固定化的L‑氨基酸氧化酶；步骤2:以L‑丙氨酸作为反应底物，在上述固定化的L‑氨基酸氧化酶的作用下氧化脱氨得到L‑丙酮酸。

【技术特征摘要】
1.一种酶法转化L-丙氨酸制备丙酮酸的方法，其特征在于：步骤1:向湿菌体溶液中加入丙烯酰胺单体和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺，在加速剂四甲基乙二胺和催化剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状的固定化酶凝胶，进而制取固定化的L-氨基酸氧化酶；步骤2:以L-丙氨酸作为反应底物，在上述固定化的L-氨基酸氧化酶的作用下氧化脱氨得到L-丙酮酸。2.根据权利要求1所述的一种酶法转化L-丙氨酸制备丙酮酸的方法，其特征在于：所述湿菌体为含有L-氨基酸氧化酶的大肠杆菌体。3.根据权利要求1所述的一种酶法转化L-丙氨酸制备丙酮酸的方法，其特征在于：所述湿菌体溶液为湿菌体硅油-水溶液。4.根据权利要求3所述的一种酶法转化L-丙氨酸制备丙酮酸的方法，其特征在于：所述硅油-水溶液的浓度为80%。5.根据权利要求3所述的一种酶法转化L-丙氨酸制备丙酮酸的方法，其特征在于：步骤1中，制取湿菌体溶液的方法为：将湿菌体均匀的分散在硅油-水溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌水，米造吉，何连顺，马静，杨涛，
申请(专利权)人：精晶药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13