构建水稻白叶枯病菌Ⅲ型分泌系统转运目标蛋白到植物体内的表达载体及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种利用水稻白叶枯病菌Ⅲ型分泌系统转运目标蛋白到植物体内的表达载体及其应用。本发明专利技术保护一种特异DNA分子，依次包括如下区段：区段甲、区段乙和区段丙；所述区段甲为HrcC启动子；所述区段乙为TAL信号肽；所述区段丙为转录终止序列。含有以上所述特异DNA分子的重组载体也属于本发明专利技术的保护范围。本发明专利技术还保护以上任一所述重组载体的应用，为表达目的蛋白并将其转运至植物细胞。本发明专利技术可用于鉴定待测蛋白是否为效应蛋白。本发明专利技术提供了一种简单易行且可批量操作的方法，该方法可将分泌蛋白强制分泌到植物体内，从而筛选出有重大生物学意义的效应蛋白。该发明专利技术对于植物病原菌致病机制的研究起到了一定的促进作用。

Construction of expression vector of transfer target protein of rice bacterial blight pathogen type III to plant and its application

The invention discloses an expression vector for transferring target proteins into plant bodies by using the secretion system of rice type III pathogenic bacteria of Xanthomonas oryzae and its application. The invention protects a specific DNA molecule, includes the following sections: Section A, Qu Duanyi and the Qu Duanjia section C; HrcC promoter; the section B of TAL signal peptide; the section C for transcription termination sequences. A recombinant carrier containing the said specific DNA molecules also belongs to the scope of protection of the present invention. The present invention also protects the use of any of the recombinant vectors for expressing desired proteins and transferring them to plant cells. The present invention can be used to identify whether the protein to be tested is an effector protein. The present invention provides a simple and mass manipulation method for secreting secreted proteins into plants so as to screen a biologically significant effector protein. The invention plays a certain role in promoting the study of the pathogenic mechanism of plant pathogenic bacteria.

【技术实现步骤摘要】
构建水稻白叶枯病菌Ⅲ型分泌系统转运目标蛋白到植物体内的表达载体及其应用
本专利技术属于农业微生物及基因工程
，涉及一种利用水稻白叶枯病菌Ⅲ型分泌系统转运目标蛋白到植物体内的表达载体及其应用。
技术介绍
许多植物和动物病原菌都配备有效应蛋白(translocatedeffectorproteins)作为其“分子兵工厂”，效应蛋白能帮助病原菌感染宿主并在宿主中定殖。效应蛋白对于病原菌在植物/动物中的增殖和侵染具有极其重要的作用。随着各种病原菌(细菌、真菌等)基因组测序的完成，本领域技术人员通过生物信息学分析预测了数目庞大的分泌型蛋白质。但生物信息学仅能对蛋白质的功能进行预测，预测结果的准确性无法确保，因此蛋白质是否真的具有预测的功能，仍然需要试验验证。很多病原菌分泌蛋白的含量很低且分泌方式不明确，很多寄生性真菌无法在人工培养基上培养，也没有办法进行遗传操作，因此研究这些病菌侵染时所分泌蛋白的功能非常困难。如何从数目庞大的预测蛋白中快速有效的筛选出对致病菌存在重要作用的效应蛋白就变得极其有意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用水稻白叶枯病菌Ⅲ型分泌系统转运目标蛋白到植物体内的表达载体及其应用。本专利技术首先保护一种特异DNA分子，自上游至下游依次包括如下区段：区段甲、区段乙和区段丙；所述区段甲为HrcC启动子；所述区段乙为TAL信号肽；所述区段丙为转录终止序列。所述区段甲具体可如序列表的序列1第7-524位核苷酸所示。所述区段乙具体可如序列表的序列1第525-674位核苷酸所示。HrcC启动子和TAL信号肽的物种来源均为XOO生理小种PX099。所述特异DNA分子中，所述区段乙和区段丙之间还具有限制性内切酶的识别序列。所述限制性内切酶具体可为限制性内切酶SacⅠ。所述转录终止序列具体可为NOS转录终止序列。所述区段丙具体可如序列表的序列1第690-965位核苷酸所示。所述特异DNA分子具体可为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1第7-965位核苷酸所示的DNA分子；(a2)序列表的序列1所示的DNA分子。含有以上任一所述特异DNA分子的重组载体也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体具体可为在出发载体中插入以上任一所述特异DNA分子得到的重组载体。所述出发载体具体可为PUFR034载体。所述重组载体具体可为在PUFR034载体的EcoRI和KpnI酶切位点之间插入序列表的序列1第7至965位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒。本专利技术还保护以上任一所述特异DNA分子的应用，为表达目的蛋白并将其转运至植物细胞。所述目的蛋白具体可为mCherry蛋白、含有mCherry蛋白的融合蛋白或avrxa10蛋白。所述mCherry蛋白具体可为序列表的序列2中第1-708位核苷酸所示DNA分子编码的蛋白质。所述含有mCherry蛋白的融合蛋白具体可为序列表的序列2所示核苷酸所示DNA分子编码的蛋白质。所述avrxa10蛋白具体可为序列表的序列4所示DNA分子编码的蛋白质。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为水稻，更具体可为日本晴水稻。所述应用中，所述特异DNA分子借助水稻白叶枯病菌导入植物。所述水稻白叶枯病菌具体可为生理小种PX099。本专利技术还保护以上任一所述重组载体的应用，为表达目的蛋白并将其转运至植物细胞。所述目的蛋白具体可为mCherry蛋白、含有mCherry蛋白的融合蛋白或avrxa10蛋白。所述mCherry蛋白具体可为序列表的序列2中第1-708位核苷酸所示DNA分子编码的蛋白质。所述含有mCherry蛋白的融合蛋白具体可为序列表的序列2所示核苷酸所示DNA分子编码的蛋白质。所述avrxa10蛋白具体可为序列表的序列4所示DNA分子编码的蛋白质。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为水稻，更具体可为日本晴水稻。所述应用中，所述重组载体借助水稻白叶枯病菌导入植物。所述水稻白叶枯病菌具体可为生理小种PX099。本专利技术还保护以上任一所述特异DNA分子的应用，为鉴定待测蛋白是否为效应蛋白。本专利技术还保护以上任一所述重组载体的应用，为鉴定待测蛋白是否为效应蛋白。本专利技术还保护一种鉴定待测蛋白是否为效应蛋白的方法，包括如下步骤：(1)将待测蛋白的编码基因插入以上任一所述重组载体的所述区段乙和所述区段丙之间且所述编码基因与所述区段乙位于同一个编码框，得到重组质粒；(2)将步骤(1)得到的重组质粒导入出发菌，得到重组菌；所述初发菌为水稻白叶枯病菌；(3)分组操作如下：实验组：将所述重组菌导入植物，然后观察植物发病情况；对照组：将所述出发菌导入植物，然后观察植物发病情况；在平行操作的前提下，如果实验组植物的发病程度不同于对照组植物，待测蛋白为效应蛋白。所述效应蛋白为具有改变植物病原菌侵染宿主植物的功能的蛋白质。所述改变具体可为促进。“实验组植物的发病程度不同于对照组植物”具体可为“实验组植物的发病程度高于对照组植物”。步骤(1)中，所述待测蛋白的编码基因具体可通过重组插入所述重组载体的所述区段乙和所述区段丙之间。步骤(1)中，“将待测蛋白的编码基因插入以上任一所述重组载体的所述区段乙和所述区段丙之间”的实现方式具体如下：①用限制性内切酶SacⅠ酶切所述重组载体，回收线性化载体；②在待测蛋白的编码基因的5’末端增加片段甲(片段甲具体可为如下序列：CGGACGATGTCCGAGCTC)、3’末端增加片段乙(片段乙具体可为如下序列的反向互补序列：ACGATCTGCAGCGAGCTC)；所述片段甲由15-20个核苷酸组成，末尾的6个核苷酸为限制性内切酶SacⅠ的识别序列；所述片段乙由15-20个核苷酸组成，起始的6个核苷酸为限制性内切酶SacⅠ的识别序列；③取步骤①得到的线性化载体和步骤②得到的DNA分子，采用IIOneStepCloningKit进行重组操作，得到所述重组质粒。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为水稻，更具体可为日本晴水稻。所述水稻白叶枯病菌具体可为生理小种PX099。所述方法中，具体可将所述重组菌或所述出发菌的菌悬液注射到所述植物的叶片中。所述方法中，实验组具体可将所述重组菌的菌悬液注射到所述植物的叶片中，对照组具体可将所述出发菌的菌悬液注射到所述植物的叶片中，7天后观察植物发病情况。所述菌悬液具体可为OD600nm＝0.5的菌悬液。所述菌悬液的具体制备方法可为：用10mM的MgCl2水溶液重悬所述重组菌或所述出发菌。本专利技术还保护一种鉴定待测蛋白是否为效应蛋白的试剂盒，包括以上任一所述重组载体和水稻白叶枯病菌。所述水稻白叶枯病菌具体可为生理小种PX099。本专利技术提供的载体，借助Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)的Ⅲ型分泌系统将待测蛋白质强制分泌到植物体内。本专利技术提供了一种简单易行且可批量操作的方法，该方法可将分泌蛋白强制分泌到植物体内，从而筛选出有重大生物学意义的效应蛋白。该专利技术对于植物病原菌致病机制的研究起到了一定的促进作用。附图说明图1为实施例2的结果。图2为实施例3的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA分子，自上游至下游依次包括如下区段：区段甲、区段乙和区段丙；所述区段甲为HrcC启动子；所述区段乙为TAL信号肽；所述区段丙为转录终止序列。

【技术特征摘要】
1.一种DNA分子，自上游至下游依次包括如下区段：区段甲、区段乙和区段丙；所述区段甲为HrcC启动子；所述区段乙为TAL信号肽；所述区段丙为转录终止序列。2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：所述区段甲如序列表的序列1第7-524位核苷酸所示；所述区段乙如序列表的序列1第525-674位核苷酸所示。3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子中，所述区段乙和区段丙之间还具有限制性内切酶的识别序列。4.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述区段丙如序列表的序列1第690-965位核苷酸所示。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述DNA分子为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1第7-965位核苷酸所示的DNA分子；(a2)序列表的序列1所示的DNA分子。6.含有权利要求1至5中任一所述DNA分子的重组载体。7.权利要求1至5中任一所述DNA分子或权利要求6所述重组载体的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘俊，余永旗，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11