一种恒温条件下合成核酸的方法技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体地，本发明专利技术涉及一种恒温条件下合成核酸的方法。本发明专利技术包括以下步骤：1)提供一种核酸，所述核酸的3’末端具有与同一条链上的F1c区退火的F1r区，并且通过所述F1r区与Flc区的同时退火可形成螺旋环；2)以步骤1)所述核酸为模板合成其自身的互补链；3)通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而进行互补链合成，以置换步骤2)中所合成的互补链。本发明专利技术所述寡核苷酸在引物的5’‑侧所提供的核苷酸序列，基本上与以该引物为合成起点而合成的区域相同。本发明专利技术在单纯试剂的组成上实现了基于恒温反应的核酸合成。

Method for synthesizing nucleic acid under constant temperature

The invention relates to the technical field of gene engineering, in particular to a method for synthesizing nucleic acid under constant temperature. The invention comprises the following steps: 1) a nucleic acid, 3 'end of the nucleic acid with F1c and annealing on the same strand of the F1r region, and through the F1r and Flc regions at the same time, annealing can form spiral ring; 2) to step 1) the nucleic acid synthesis of complementary chain its own template; 3) by the polymerase catalytic chain replacement complementary strand synthesis reaction of a complementary strand synthesis, the replacement step 2) complementary chain synthesis. The nucleotide sequences of the oligonucleotides of the invention provides a primer on the 5 'side, basically with the primers for the synthesis and synthesis of the same region starting point. In the invention, nucleic acid synthesis based on constant temperature reaction is realized on the basis of the formation of a simple reagent.

【技术实现步骤摘要】
一种恒温条件下合成核酸的方法
本专利技术涉及基因工程
，具体地，本专利技术涉及一种恒温条件下合成核酸的方法，特别涉及由特异性核苷酸序列构成的可形成特殊结构核酸的合成方法，及基于该特异性核酸序列的一种有用的扩增核酸的方法。
技术介绍
生物体所携带基因信息的生物体的最根本差异，基于核苷酸序列互补性的分析方法可直接分析基因所携带的遗传特征。该分析是一种鉴定遗传疾病、癌变、微生物等非常强有力的方法。当样品中靶基因含量非常少时一般不易检测，因此必须对靶基因进行扩增或使其检测信号放大。作为扩增靶基因的方法，PCR方法被认为是最经典方法(Saiki，Gelfandetal.1988)，亦是体外核酸序列扩增应用最为普遍的技术。该方法指数式扩增结果使其具有高灵敏度，确立了其在分子生物学方法检测领域的地位，经几十年发展已有系列成熟产品。此外，扩增产物可回收使用，因此作为一种支持遗传工程技术如基因克隆和结构决定的重要工具，亦得到广泛应用。然而，PCR方法明显有下述的问题：实际操作中必须要用专门的程序温度控制系统；扩增反应的指数式上升导致难于定量；样品和反应溶液易受到外部污染，假阳性问题较为突出。当前人类基因组计划已经完成，单核苷酸多态性(SNPs)显示出数量多、分布广泛的特点，故其分析逐步受到重视。通过设计引物使其核苷酸序列包含SNPs，依靠PCR扩增来检测SNPs是可行的，即通过是否存在与引物互补的核苷酸序列可通过是否存在反应产物的决定得出推断。然而，一旦PCR中偶然误合成互补链，在接下去的反应中该产物以模板运行，就会造成错误的结果。实际应用中，若引物末端仅一个碱基不同则将很难严格控制PCR，故必须改进特异性使PCR更好应用于SNPs的检测上。另一方面，相较于繁琐的程序温控过程合成核酸，科学家亦开发出在恒温条件下合成核酸的技术(Zhao，Chenetal.2015)，主要包括以下几种：依赖核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)，链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、依赖解旋酶的扩增(HDA)、重组聚合酶扩增(RPA)。NASBA，也称TMA(转录介导扩增方法)不需要复杂的温度控制。该方法通过DNA聚合酶以靶RNA为模板，加入连接有T7启动子的探针而得以合成，第二探针进入双链使产物得以生成，接着以生成的双链DNA为模板通过T7RNA聚合酶转录而扩增得到大量的RNA产物。NASBA需要热变性步骤直到双链DNA形成，但是接下去的转录反应在等温条件下通过T7RNA聚合酶得以进行。必须要用多种酶组合例如反转录酶，RNaseH，DNA聚合酶和T7RNA聚合酶，然而多种酶的组合对于费用是不利的。同时由于复杂的多种酶反应条件设定，该方法很难作为一般的分析方法得以推广。RCA(滚环扩增，RollingCircleAmplification)旨在模仿微生物中环状DNA的滚环复制过程，对于环状单链DNA模板，与该模板相结合的引物在原方法仅能实现对于环状核酸的扩增。为使得该方法可通用于线性DNA的扩增，通过挂锁探针(padlockprobe)或环形探针互补的单链DNA显示具有一系列核苷酸序列与挂锁探针(padlockprobe)或环形探针互补的单链DNA在靶核苷酸存在下可被连续的合成(Lizardi，Huangetal.1998)。该方法亦存在需多种酶的问题。而且，互补链合成的启动取决于连接两邻近区的反应，并且其特异性基本上与LCR中的相同。链替代扩增(StrandDisplacementAmplification，SDA)方法也是人们所知的扩增具有序列与靶序列互补的模板DNA的方法(Zhang，Cuietal.1992)。SDA方法应用特定的DNA聚合酶从目标核苷酸序列3’-侧互补的引物开始合成互补链以替换双链5’-侧的序列。由于新合成的互补链替换了5’-侧的双链，称该项技术为SDA方法。SDA方法中限制酶识别序列作为引物预先插入到退火序列中就可去除PCR方法中必须的温度变化步骤。即通过限制酶生成的切口供给3’-OH基作为互补链的合成起点，并且先合成的互补链通过链置换合成得以释放单链，接着再次作为模板用于下面的互补链合成。但SDA扩增产物与天然核酸结构不同，并且对用限制酶来断裂或将扩增产物应用到基因克隆上存在限制。这方面也是导致费用较高的主要原因。另外，SDA方法应用在未知序列时，用于引入缺口的限制酶识别序列相同的核苷酸序列可能存在于要被合成的区中，如此可能阻止完全互补链的合成。依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(Helicase-dependentIsothermalDNAAmplification，HAD)是由美国NEB公司研究人员于2004年专利技术的一种新型核酸恒温扩增技术(Vincent，Xuetal.2004)。该技术模拟自然界生物体内DNA复制的自然过程，在恒温条件下利用解旋酶解开DNA双链，同时DNA单链结合蛋白(single-strandedDNA-bindingprotein，SSB)用以稳定解开的单链，并为引物提供结合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互补链。新合成的双链在解旋酶的作用下又解成单链，并作为下一轮合成的模板进入上述的循环扩增反应，最终实现靶序列的指数式增长。LAMP技术(Notomi，Okayamaetal.2000)的核心是利用针对靶基因上的六个区域设计四条特异性引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。该技术可在15-60分钟内实现109-1010倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在，日本荣研公司亦针对性开发出浊度仪以实现扩增反应实时监测。LAMP方法的优势除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，在应用阶段对仪器的要求低，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可，是一种适合现场、基层快速检测的方法。其中一个局限，因该方法高特异性和灵敏度等特点依赖于4条引物的性质，最佳引物的获得通常需要进行序列比对、在线引物设计、引物筛选及特异性试验，这一过程十分繁琐。重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)，其要点在于：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，随后链置换DNA聚合酶即会介导链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与单链结合蛋白(SSB)结合，以防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。但整个过程中需要筛选能与重组酶的结合并且特异性良好的引物，同时需要使用三种酶将极大增加其成本。解放军军事医学科学院的刘威等(Liu，Dongetal.2015)提出了一种称为聚合酶螺旋反应(PSR)的新型核酸等温扩增技术，该反应使用与LAMP反应一样的酶，通过在设计的PCR引物的5’端引入特定序列进行扩增形成5’和3’端可以自组装形成闭合螺旋状的结构以提供3’-OH作为合成的起点，并以之为扩增起始结构，而后大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种恒温条件下合成核酸的方法，包括以下步骤：1)提供一种核酸，所述核酸的3’末端具有与同一条链上的F1c区退火的F1r区，并且通过所述F1r区与Flc区的同时退火形成螺旋环；2)以步骤1)所述核酸为模板合成其自身的互补链，所述互补链的R1rc区与R1区退火，而Flc区退火的F1r区的3'末端组成螺旋环，作为合成起点；3)通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而进行互补链合成，以置换步骤2)中所合成的互补链，其中所述多核苷酸在其3’末端包含一种与步骤2)中合成的互补链的任意区域互补的序列。

【技术特征摘要】
1.一种恒温条件下合成核酸的方法，包括以下步骤：1)提供一种核酸，所述核酸的3’末端具有与同一条链上的F1c区退火的F1r区，并且通过所述F1r区与Flc区的同时退火形成螺旋环；2)以步骤1)所述核酸为模板合成其自身的互补链，所述互补链的R1rc区与R1区退火，而Flc区退火的F1r区的3'末端组成螺旋环，作为合成起点；3)通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而进行互补链合成，以置换步骤2)中所合成的互补链，其中所述多核苷酸在其3’末端包含一种与步骤2)中合成的互补链的任意区域互补的序列。2.根据权利要求1所述的合成核酸的方法，其特征在于，步骤1)所述核酸的制备方法，包括以下步骤：i)退火步骤，使第一寡核苷酸I与模板的F1c区退火，其中该模板的3’末端包括F1c区和位于F1c区3’侧的F2c区，该模板的5’末端包括R1区和位于R1区5’侧的R2区，其中所述第一寡核苷酸I，包括R1r区与Fl区，所述Rlr区与F1区的5’侧相连，其中，F1区：具有与模板F1c区互补的核苷酸序列的区，R1r区：与模板R1区反向的区；ii)合成第一核酸的步骤，所述第一核酸具有与所述模板互补的核苷酸序列，此步骤以第一寡核苷酸I的F2区作为合成的起点合成第一核酸，所述第一核酸的3'末端具有与同一条链上的部分F1c区退火的F1区，并且通过所述F1区与Flc区的同时退火形成的螺旋环；iii)利用聚合酶催化链置换反应置换步骤ii)中合成的第一核酸，其中与模板中的F1c的3’侧的F2c区退火的第一外引物I用作合成的起点，和iv)退火步骤，使第二寡核苷酸II与步骤iii)所得第一核酸的R1c区退火，其中所述第二寡核苷酸II包括R1区和F1r区，并且Flr区与R1区的5’侧相连，第二寡核苷酸II为第一寡核苷酸I的反向序列；其中，R1区：具有与第一核酸的R1c区互补的核苷酸序列的区，Flr区：与第一核酸的F1区反向的区；v)以所述第二寡核苷酸II作为合成的起点，合成第二核酸，并利用聚合酶催化链置换反应置换该第二核酸获得步骤1)所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜昱光，毛瑞，刘洪涛，王倬，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11