杂交瘤细胞株Jnw1D2及其产生的抗甲萘威单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及杂交瘤细胞株Jnw1D2及其产生的抗甲萘威单克隆抗体。本发明专利技术提供的杂交瘤细胞株Jnw1D2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201654。其可以用于制备高效价抗甲萘威单克隆抗体，抗甲萘威鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得效价可达1.6×10

Anti carbaryl monoclonal antibody hybridoma cell line Jnw1D2 and its

The present invention relates to anti carbaryl monoclonal antibody hybridoma cell line Jnw1D2 and its. Hybridoma cell strains preserved in Jnw1D2 provided by the invention in China type culture collection center, the preservation number is CCTCC NO:C201654. It can be used for the preparation of high titer anti carbaryl monoclonal antibody, anti carbaryl mouse ascites antibody enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method to measure the titer of 1.6 * 10

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株Jnw1D2及其产生的抗甲萘威单克隆抗体
本专利技术涉及杂交瘤细胞株Jnw1D2及其产生的抗甲萘威单克隆抗体。
技术介绍
甲萘威是一种氨基甲酸酯类光谱杀虫剂，对于害虫具有触杀、胃毒作用，在我国农业生产中广泛使用，在世界范围内农产品及食品的农药残留检测中检出率最高的农药之一。甲萘威对哺乳动物具有中等毒性，对小鼠的半致死剂量(LD50)为300mg/kg。欧盟化学品审查委员会已提出禁止使用甲萘威，认为其属于第三类致癌物质。主要残留在谷物、水果和蔬菜中，对消费者健康具有潜在的威胁。因此，加强对甲萘威的检测是保障农产品及食品安全的一个重要环节。我国甲萘威在谷物中限量为0.5-1mg/kg，蔬菜中为1mg/kg，茶叶中为1mg/kg。目前用于甲萘威的检测方法主要采用基于色谱原理的紫外-高效液相色谱法、二极管矩阵-高效液相色谱法、荧光-高效液相色谱法(high-performanceliquidchromatography,HPLC)、质谱-高效液相色谱法等，这些方法灵敏度高、检测结果可靠。但是前处理和分析步骤复杂，需要专业的仪器，对操作人员专业性要求较高，检测成本高，耗时长。不适合现场大批量样品筛查检测。免疫分析方法克服了以上缺点，具有操作简单、成本低廉、不需专业仪器设备，适合现场筛查的特点。已经广泛应用于农产品检测领域。免疫分析以抗原抗体特异性结合反应为基础，通过标记物对抗体或抗原进行标记，将微量目标物信号放大，从而实现定量检测，抗体的灵敏度和特异性决定了所建立的免疫技术检测结果的准确度。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株Jnw1D2及其产生的抗甲萘威单克隆抗体。本专利技术提供了杂交瘤细胞株Jnw1D2，该杂交瘤细胞株已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:C201654。其具有序列表中SEQIDNO.1所示的抗甲萘威单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQIDNO.2所示的抗甲萘威单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。本专利技术进一步提供了抗甲萘威单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCCNO:C201654的杂交瘤细胞株Jnw1D2分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQIDNO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。该抗甲萘威单克隆抗体可以识别甲萘威，对甲萘威的50％抑制浓度IC50为0.668ng/mL。上述抗甲萘威单克隆抗体在甲萘威含量测定中的应用。杂交瘤细胞株Jnw1D2的具体筛选步骤如下：将BALB/c小鼠经甲萘威完全抗原CNH-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的完全抗原CNH-BSA做最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，待细胞融合后2-3周，用微量移液器将单个细胞集落移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，进行第一次克隆，然后采用ELISA方法分两步筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗甲萘威而不抗载体蛋白BSA的阳性孔，第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用甲萘威标准品作为竞争原，选择吸光值和抑制率均较高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复亚克隆4-5次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株Jnw1D2。本专利技术提供的抗甲萘威单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将上述获得的杂交瘤细胞株Jnw1D2注射到预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠的腹部，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗甲萘威单克隆抗体。按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体步骤为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上。12000r/min，4℃离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，冰浴中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后12000r/min，4℃离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10体积的摩尔浓度为0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/LPBS透析两天将透析袋中蛋白溶液取出，离心，收集上清，弃沉淀，放入-70℃预冻后放入冻干机中冻干。收集冻干粉，即为纯化好的抗甲萘威单克隆抗体；所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术提供的杂交瘤细胞株Jnw1D2可以用于制备高效价甲萘威单克隆抗体，通过酶联免疫吸附法(ELISA)测得抗体的效价可达1.6×104。(2)本专利技术提供的抗甲萘威单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对甲萘威的50％抑制浓度IC50为0.668ng/kg，与克百威、涕灭威、灭多威等无交叉反应。(3)本专利技术提供的甲萘威单克隆抗体可应用于甲萘威含量的测定。具体实施方式实施例1：杂交瘤细胞株Jnw1D2的筛选1.动物免疫购买6周龄BALB/c小鼠6只，用6-(1-萘氧基甲酰胺)-己酸(CNH)偶联牛血清白蛋白(BSA)，获得甲萘威完全抗原CNH-BSA，免疫小鼠。第一次免疫将甲萘威完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于3周后进行，采用弗氏不完全佐剂与等体积的甲萘威完全抗原乳化，于小鼠颈背部皮下多点注射。第三次与第四次免疫分别与上一次免疫间隔两周，免疫方式与第二次相同。四次免疫剂量相同，仅为100μg/只。第三次免疫后第7天，小鼠尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行加强免疫，免疫剂量为之前量的2倍。2.细胞融合于加强免疫3天后，采用50％(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为1450)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下脱颈处死待融合小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5：1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，1200rpm，离心5min。弃去上清，控干，加入1mLPEG，融合1分钟，缓慢加入RPMI-1640基础培养液，离心，弃上清，沉淀即为融合细胞，用20mL含1％HAT的完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板上，2mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养。所述的含1％HAT的细胞完全培养基含有20％(体积百分数)胎牛血清，75％(体积百分数)RPMI本文档来自技高网...

【技术保护点】
杂交瘤细胞株Jnw1D2，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201654。

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株Jnw1D2，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C201654。2.抗甲萘威单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCCNO:C201654的杂交瘤细胞株Jnw1D2分泌产生，所述抗体的重链可变区编码基因序列如SEQIDNO.1所示，轻链可变区编码基因序...

【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，唐晓倩，张奇，张文，姜俊，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42