抗USP2a蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗USP2a单克隆抗体和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗USP2a蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗USP2a单克隆抗体和应用。本发明专利技术公开的一株杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株3D9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2016186；该杂交瘤细胞株3D9分泌产生了抗USP2a的单克隆抗体；该抗USP2a的单克隆抗体可以应用在肿瘤组织切片免疫组织化学检测中。本发明专利技术的杂交瘤细胞株3D9分泌产生的抗USP2a的单克隆抗体具有效价高、性质稳定和特异性强等特点。

Anti USP2a protein monoclonal antibody hybridoma cell and anti USP2a monoclonal antibody produced by the cell and application thereof

The invention discloses an anti USP2a protein monoclonal antibody hybridoma cell and an anti USP2a monoclonal antibody produced by the hybridoma cell and an application thereof. The invention discloses a hybridoma cell line, named hybridoma 3D9, deposited in the Chinese type culture collection center, the preservation number is CCTCC NO:C2016186; the hybridoma cell strain 3D9 secreted anti USP2a monoclonal antibody; monoclonal anti USP2a antibody which can be used in tumor tissue immunity histochemical detection. The monoclonal antibody against USP2a produced by the hybridoma cell line 3D9 has the characteristics of high potency, stable property and strong specificity.

【技术实现步骤摘要】
抗USP2a蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗USP2a单克隆抗体和应用一、
：本专利技术涉及一种抗USP2a单克隆抗体及其应用，属于分子免疫学
；具体涉及一种抗USP2a蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗USP2a单克隆抗体和在肿瘤组织切片免疫组织化学检测中的应用。二、
技术介绍
：USP2又称泛素特异性蛋白酶2，是去泛素化酶家族，泛素特异性蛋白酶的成员，USP2基因定位于11号染色体长臂(11q23.3)，最早是在大鼠睾丸中经克隆鉴定出来的。USP2基因经过5’末端的选择性剪切可产生两个不同的亚基USP2a(USP2-69；UBP-t2)和USP2b(USP2-45；UBP-t1)，但它们都拥有基因3’末端的催化结构域。研究证明，当USP2a在未转变的细胞中超表达时，显示出致癌性，并且能阻止化疗因子诱导的凋亡；而在多种肿瘤细胞株中，USP2a基因沉默能诱导细胞凋亡。USP2a在人前列腺癌细胞中高表达，高表达的USP2a能够稳定脂肪酸合成酶(fattyacidsynthase:FAS)，FAS在包括前列腺癌在内的许多恶性肿瘤中超表达，并能促进细胞增生，并且FAS的表达与前列腺癌的级别密切相关。通过siRNA作用下调USP2a的表达后发现，FAS含量降低，导致细胞凋亡。另外USP2a的异常表达能够使MDM2以剂量依赖形式聚集，同时能促进MDM2介导的p53降解，而抑制USP2a则能使MDM2不稳定，从而引起p53蛋白的聚集和激活。除此之外，在膀胱癌、卵巢癌和胃癌等的研究中均发现USP2a与癌细胞增生和迁移密切相关。这些实验结果都证明USP2a与肿瘤的发生、发展有重要的联系，USP2a是治疗肿瘤的又一个重要靶点。USP2a单克隆抗体药物具有广泛的应用前景，可用于多个类型肿瘤的检测和治疗，主要包括：前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌和胃癌等。因此，开发与USP2a具有高亲和力的抗体药物，用于癌症的检测和免疫治疗，使其具有更好的治疗效果、更低的毒副作用具有重要的意义。然而，目前现有的USP2a抗体药物亲和力低，尚缺少一种具有高亲和力的USP2a抗体。三、
技术实现思路
：本专利技术要解决的技术问题是：提供一种抗USP2a蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株(命名为杂交瘤细胞株3D9)及其产生的抗USP2a单克隆抗体和应用。本专利技术的杂交瘤细胞株3D9分泌产生的抗USP2a的单克隆抗体具有效价高、性质稳定和特异性强等特点。本专利技术要解决的技术问题是采用如下技术方案实现的：本专利技术提供了杂交瘤细胞株3D9，该杂交瘤细胞株3D9已于2016年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：C2016186；经检测为存活。本专利技术提供了抗USP2a的单克隆抗体，它是由保藏编号为CCTCCNO：C2016186的杂交瘤细胞株3D9分泌产生。本专利技术还提供了抗USP2a的单克隆抗体在肿瘤组织切片免疫组织化学检测中的应用。本专利技术抗USP2a单克隆抗体的制备方法，主要步骤为：克隆重组USP2a基因，表达USP2a融合蛋白，以USP2a融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，用免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，采用间接酶联免疫吸附法(ELSA)筛选产生USP2a单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，利用所得阳性杂交瘤细胞株进行克隆化，并采用间接酶联免疫吸附法(ELSA)筛选克隆化后的杂交瘤细胞产生的USP2a单克隆抗体的效价，选取效价最高的杂交瘤细胞株即得到杂交瘤细胞株3D9，将所得的杂交瘤细胞株3D9腹腔注射BABL/c小鼠，收集腹水即得到USP2a单克隆抗体。本专利技术对USP2a单克隆抗体制备过程中涉及到的几个方面进行以下详细描述：1)USP2a具体是指在前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌和胃癌等多种肿瘤组织中表达异常的USP2a基因，该基因在未转变的细胞中超表达时，显示出致癌性，并且能阻止化疗因子诱导的凋亡；普通的检测方法速度较慢、耗时较长和特异性不佳。本专利技术在制备USP2a单克隆抗体的方法中通过PCR扩增获得USP2a基因，构建USP2a重组克隆，并优化表达条件使重组蛋白实现分泌型表达；分泌型表达的USP2a融合蛋白空间结构接近天然蛋白，具有很高的酶活性能够激发免疫细胞产生特异性抗体。实验证明，通过本专利技术所述方法制备的USP2a单克隆抗体具有效价高、性质稳定和特异性强等特点。2)重组蛋白的制备与纯化过程：按照NCBIGenBank上公布的USP2amRNA编码序列(GenBankID：BC002854)进行分析，设计引物(上游引物：5’GGAATTCATGAATTCTAAGAGTGCCCAGG3’，下游引物：5’CCGCTCGAGCTACATTCGGGAGGG3’)，在上、下游引物上分别加入EcoRI和XhoI酶切位点，以前列腺癌细胞cDNA为模板进行PCR扩增，获得USP2a基因，采用EcoRI和XhoI分别双酶切PCR产物和载体pET28a(+)，之后进行连接、筛选，获得重组质粒pET28a-USP2a，重组质粒pET28a-USP2a在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达，优化表达条件，在30℃温度条件下进行表达，离心收集细胞菌体，超声破碎，离心弃沉淀，上清经过镍离子亲和层析纯化收集，进一步浓缩，获得纯化的USP2a融合蛋白。3)USP2a单克隆抗体的制备过程为：(a)将纯化得到的USP2a融合蛋白作为抗原与福氏完全佐剂充分乳化后皮下注射小鼠，再分别于3周、6周后用USP2a融合蛋白作为抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后各免疫1次，8周后用相同剂量的USP2a融合蛋白作为抗原腹腔注射小鼠；(b)最后一次注射3天后，取上述免疫小鼠的脾细胞进行细胞融合；骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10的比例混合在一起，在50mL离心管中用无血清1640不完全培养基洗涤1次，1200rpm离心8min，弃上清，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动；90s内加入37℃、预温的1mL45％聚乙二醇PEG(分子量4000)溶液(PEG的温度为37℃)，边加边轻微摇动；之后在37℃水浴中作用90s；再分别加入37℃预温的1640不完全培养基1mL、2mL、3mL、4mL、5mL和6mL以终止PEG作用，每次加入的时间间隔为2min；800rpm离心6min，弃上清，得到细胞；用含20％小牛血清HAT选择培养基对离心所得细胞进行重悬；将重悬后的细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μL；将培养板置37℃、5％CO2培养箱中进行培养；(c)利用间接ELISA检测方法，对步骤(b)中96孔板内每个孔中细胞的培养液中的抗体进行检测，筛选出抗体阳性杂交瘤细胞。(d)采用有限稀释法对步骤(c)筛选出的抗体阳性杂交瘤细胞进行克隆化，先将要克隆的杂交瘤细胞计数，调整细胞浓度为3～10个细胞/mL；取头天准备的具有饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入调整浓度后的细胞100μL；孵育于37℃、5％CO2培养箱中；在第7天换液，以后每2～3天换液1次；8～9天可见细胞克隆形成，利用间接ELISA检测方法检测每个孔中细胞培养液中的抗体活性，将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养；扩大培养后得到杂交瘤细胞；(e)取小鼠，以0.5mL/只本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杂交瘤细胞株，其特征在于：命名为杂交瘤细胞株3D9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2016186。

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：命名为杂交瘤细胞株3D9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2016186。2.一种抗USP2a的单克隆抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：张万方，李鹏，潘鹏涛，孙寅玮，何勇，任鹏举，王孟慧，黄向瑜，樊松乐，徐磊，
申请(专利权)人：新乡学院，
类型：发明
国别省市：河南,41