本发明专利技术提供了一种稳定敲除MSTN基因的细胞系及其构建方法。该细胞系包括真核表达载体，所述的真核表达载体含有用于敲除MSTN基因的序列；构建方法为：(1)构建包括用于敲除MSTN基因的真核表达载体；(2)将所述用于敲除MSTN基因的真核表达载体转染到PK15细胞中，得到所述稳定敲除MSTN基因的PK15细胞系。本发明专利技术不仅在体外成功模拟了MSTN的表达状态，为研究MSTN基因在肌肉发育中作用提供了模型，而且也为MSTN的功能研究提供了帮助。
MSTN double knock cell line and construction method thereof
The present invention provides a cell line for stably knocking out MSTN gene and a method for constructing the same. Including the eukaryotic expression vector of the cell lines, the eukaryotic expression vector containing MSTN gene knock sequence except for; construction method as follows: (1) construct knockout MSTN gene eukaryotic expression vector for; (2) for the knockout MSTN gene eukaryotic expression vector was transfected into PK15 in the cell, and obtain the stable PK15 knockdown cell line MSTN gene. The present invention not only successfully simulates the expression state of MSTN in vitro, but also provides a model for studying the role of MSTN gene in muscle development, and also provides a basis for the study of the function of MSTN.
【技术实现步骤摘要】
MSTN双敲细胞系及其构建方法
本专利技术涉及细胞生物学
，尤其涉及一种稳定敲除MSTN基因的细胞系及其构建方法。
技术介绍
在哺乳动物中，MSTN主要在骨骼肌中表达，并且在生长时期和成熟期的骨骼肌中均有表达。在猪胚胎期21～35d可以检测到MSTNmRNA分子，在49d该基因表达水平明显提高，妊娠105d时开始降低，出生后2周达到最低水平，在生长期猪的骨骼肌、心肌和乳腺中一直有表达。TaylorWE等于2001年研究检测了重组MSTN对鼠骨骼肌细胞的影响，结果发现重组MSTN蛋白可抑制细胞的增生、DNA的合成以及蛋白质的合成，从而抑制肌肉的生长。Rios等将编码鼠MSTNcDNA重组体瞬时转染C2C12成肌细胞，有效地抑制了细胞的增殖，并发现MSTN蛋白可能具有上调细胞周期依赖性磷酸转移酶抑制因子的作用。Joulia通过稳定转染MSTN基因在骨骼肌细胞中表达，发现减少了分化过程中G0/G1期细胞的数目，另外还检测到P21和P53蛋白表达有所提高。ThomasM通过向培养基中添加MSTN蛋白，进一步证明随着该种蛋白浓度的增加，对C2C12成肌细胞的抑制作用增强，MSTN可抑制成肌细胞从C1期向S期的转化，并且Western杂交结果表明MSTN可以影响与细胞增殖相关的蛋白质的表达，如可以促进P21的表达、降低Cdk2的表达。WayneE研究表明，MSTN基因抑制C2C12细胞增生可能是通过该基因作用于TGF家族的其他成员，如丝氨酸-苏氨酸激酶家族的特异受体。这种对细胞增生的抑制作用可以通过除去MSTN而解除，对C2C12的抑制作用比对中国仓鼠卵巢细胞(CHO)更加明显，提供了MSTN基因优先作用于骨骼肌的证据。LeeSJ发现纯化的C-末端二聚体复合物能够作用于激活素(ACTII)受体，MSTN可与ActRIIB连接，ACT是多功能的生长因子，有促进细胞系分化，诱导胚胎中胚层发育及维持神经存活、诱导肝细胞发生凋亡等作用，其生物学活性与TGF-β有相似之处。另外，高浓度的MSTN蛋白前体还可与卵泡抑素(FS)相结合，而Fs通过与ACT结合起作用。也有研究认为MSTN可与卵泡抑素相关基因(FLRG)直接作用，二者结合的复合物是血液循环中的MSTN蛋白存在的一种主要形式，FLRG可抑制MSTN的活性。通过这条途径，MSTN基因可抑制肌肉的生长，但是各种因子相互作用的具体途径还有待进一步研究。研究还发现，MSTN基因与肌源性决定基因(MyoD)的功能相关。超表达的内源性MSTN可降低MyoD蛋白水平并诱导其磷酸化模式的改变，在成肌细胞分化周期中MyoD表达发生变化：在细胞周期的C1期MSTN启动子的活性相对较高，此时MyoD表达水平最大，认为MSTN可能是MyoD的下游靶基因，MyoD可以通过调控MSTN基因的表达来调节成肌细胞的细胞周期。总之，目前认为MSTN基因可以影响到多种与生长分化有关的蛋白质或生长因子的作用，失活MSTN基因可以解除MSTN对肌肉生长的抑制作用。
技术实现思路
鉴于失活MSTN基因可以解除MSTN对肌肉生长的抑制作用，本专利技术的目的在于提供一种稳定敲除MSTN的细胞系及其构建方法。为了实现本专利技术的目的，专利技术人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：一种稳定敲除MSTN基因的细胞系，包括真核表达载体，所述的真核表达载体含有用于敲除MSTN基因的序列。在本专利技术最优选的实施例中，所述用于敲除MSTN基因的序列为表达sgRNA的序列，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R组成，所述的sgRNA-F如序列表的序列1所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列2或序列3所示。在本专利技术最优选的实施例中，所述的细胞系为猪肾细胞PK15细胞系。在本专利技术最优选的实施例中，所述的真核载体为pX330质粒。在本专利技术最优选的实施例中，所述用于敲除MSTN基因(用于表达sgRNA)的DNA序列插入到所述pX330质粒经过BbsⅠ酶切形成的粘性末端之间。本专利技术的第二个目的在于提供一种稳定敲除MSTN基因的细胞系的构建方法，包括如下步骤：(1)设计sgRNA，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R组成，所述的sgRNA-F如序列表的序列1所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列2或序列3所示，逆转录得到表达sgRNA的序列；(2)利用表达sgRNA的序列构建包括用于敲除MSTN基因的真核表达载体；(3)将所述用于敲除MSTN基因的真核表达载体转染到PK15细胞中，得到所述稳定敲除MSTN基因的PK15细胞系。在本专利技术构建方法最优选的一个实施例中，所述用于敲除MSTN基因的序列为表达sgRNA的序列，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R组成，所述的sgRNA-F如序列表的序列1所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列2或序列3所示。在本专利技术构建方法最优选的一个实施例中，所述细胞系为PK15细胞系。在本专利技术构建方法最优选的一个实施例中，所述真核载体为pX330质粒。在本专利技术构建方法最优选的一个实施例中，所述用于敲除MSTN基因(用于表达sgRNA)的DNA序列插入到所述pX330质粒经过BbsⅠ酶切形成的粘性末端之间。本专利技术的第三个目的在于提供一对特异识别MSTN基因的sgRNA，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R组成，所述的sgRNA-F如序列表的序列1所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列2或序列3所示。本专利技术的第四个目的在于一对DNA分子，由编码权利要求7中的所述sgRNA-F的DNA分子甲和编码权利要求7中的所述sgRNA-R的DNA分子乙组成。优选地，所述的一对DNA分子，其特征在于：所述的DNA分子甲如序列表的序列4所示，所述的DNA分子乙如序列表的序列5或序列6所示。与现有技术相比，本专利技术通过在PK15细胞基因组中删除了MSTN基因的第三外显子序列中1063～1082的204bp碱基序列，构建了稳定敲除MSTN基因的细胞系，不仅在体外成功模拟了MSTN的表达状态，为研究MSTN基因在肌肉发育中作用提供了模型，而且也为MSTN的功能研究提供了帮助。附图说明图1为原始的pX330质粒的图谱；图2为稳定敲除MSTN的细胞系的构建方法的流程图；图3为western检测PK15稳定敲除MSTN基因细胞系蛋白表达量的结果图；图4为本专利技术构建的细胞模型在明场和荧光下的观察结果图；图5为载体测试以及试验载体的线性化结果图；图6为细胞基因组与供体DNA之间连接的PCR产物电泳图谱；图7为构建的Cas9/sgRNA表达载经PstnI内切酶消化后的电泳图谱；图8为供体DNA经内切酶NsiI和XhoI消化后的电泳图谱。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术的保护范围以权利要求书为准，不受下面公开的具体实施的限制。以下实施例中用到的试剂和仪器：pX330载体购自Biovector。oligodT、各种限制性内切酶和Taq酶均购自北京Inv本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种稳定敲除MSTN基因的细胞系，其特征在于，该细胞系内含有真核表达载体，所述的真核表达载体包括用于敲除MSTN基因的序列。
【技术特征摘要】
1.一种稳定敲除MSTN基因的细胞系，其特征在于，该细胞系内含有真核表达载体，所述的真核表达载体包括用于敲除MSTN基因的序列。2.根据权利要求1所述稳定敲除MSTN基因的细胞系，其特征在于，所述用于敲除MSTN基因的序列为表达sgRNA的序列，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R组成，所述的sgRNA-F如序列表的序列1所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列2或序列3所示。3.根据权利要求1所述稳定敲除MSTN基因的细胞系，其特征在于，所述的细胞系为PK15细胞系。4.根据权利要求1所述稳定敲除MSTN基因的细胞系，其特征在于，所述的真核表达载体为pX330质粒。5.根据权利要求1所述稳定敲除MSTN基因的细胞系，其特征在于，所述用于敲除MSTN基因的序列插入到所述pX330质粒经过BbsⅠ酶切形成的粘性末端之间。6.一种稳定敲除MSTN基因的细胞系的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)设计sgRNA，所述sgRNA由sgRNA-...
【专利技术属性】
技术研发人员：毕延震，肖红卫，华再东，刘西梅，张立苹，任红艳，华文君，李莉，郑新民，綦世金，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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