一种循环肿瘤细胞阴性富集方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及一种循环肿瘤细胞阴性富集方法。采用淋巴细胞分离管基础上的密度梯度离心对血样进行前处理，简化了白细胞分离操作步骤，缩短了循环肿瘤细胞的富集时间，整个操作在2.5h内即可完成；留下的白细胞数量相当于血样原始白细胞数量的30‑50％，对留下的白细胞采用自制阴性富集免疫磁珠CD45标记白细胞并去除，减少了免疫磁珠的用量，大大节约了循环肿瘤细胞阴性富集的成本；本发明专利技术采用淋巴细胞分离管对血样进行前处理，并对循环肿瘤细胞阴性富集方法进行改良，有效提高了富集操作稳定性，循环肿瘤细胞的回收率达到85％以上；本发明专利技术还具有高灵敏度的优点，可以在数量极少的样品中稳定检出循环肿瘤细胞。

Method for negative enrichment of circulating tumor cells

The invention relates to the field of molecular biology, in particular to a negative enrichment method for circulating tumor cells. By a density gradient centrifugation with lymphocyte separation tube on the basis of sample pretreatment, simplifies the operation steps of separation of white blood cells, shorten the time of enrichment of circulating tumor cells, the operation can be completed in 2.5h; leave the number of white blood cells is equivalent to the number of original blood leukocytes of 30 50%, leaving white blood cells by the self-made negative enrichment immunomagnetic CD45 labeled leukocytes and removal, reduce the amount of immunomagnetic beads, greatly saves the cost of negative enrichment of circulating tumor cells; the invention adopts the lymphocyte separation tube of blood samples before treatment, and the method of circulating tumor cells were negative enrichment improved, effectively improve the enrichment operation stability, recovery of circulating tumor cells the rate of more than 85%; the invention also has the advantages of high sensitivity, stable in minimal sample quantity Circulating tumor cells were detected.

【技术实现步骤摘要】
一种循环肿瘤细胞阴性富集方法
本专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及一种循环肿瘤细胞阴性富集方法。
技术介绍
循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，CTC)是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现远处转移的主要原因。据统计，转移是超过90％的肿瘤患者的死亡原因。近年来，随着一些基础学科相关技术的不断改进，CTC检测作为一种新型的非侵入性诊断工具，相比传统组织活检具有无创、可多次获取、可实时监测等优势，因此检测CTC被形象地称为“液体活检”，具有重要的临床研究及应用价值，已成为临床研究的热点。已有大量临床研究已经证实：通过对循环肿瘤细胞的检测，可有效地进行对多种肿瘤进行早期诊断、预后判断、监测术后复发、个体化治疗、化疗药物的快速评估、耐药性的监测等。近10年的大量临床研究表明，检测CTC数量有助于结肠癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌患者的预后评估；当CTC出现上皮间质转换(EMT)、过表达上皮细胞粘附分子(EpCAM)时，往往提示肿瘤患者预后不佳，临床研究发现，早期发现的癌症患者，90％可以治愈。但是，由于常规检测技术的局限性，早期发现癌症的人群只占少数，我国早期(Ⅰ期)癌症病人约占总体病人数5％-10％，70％的病人都属于晚期发现，这类病人5年生存率仅10％～30％。世界卫生组织早在2006年就指出癌症的防治三原则：早发现、早诊断、早治疗，可见，尽早发现是癌症防治的关键。但是在肿瘤的常规检测手段中，例如CT或核磁共振检查，对小于5毫米的肿瘤诊断比较困难，如胰腺癌、肺癌往往发现确诊以后都是中晚期的。现在发现，很多肿瘤在1毫米的情况下已经可以在血液里查到循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,CTC)。因此，早期发现微转移不仅对肿瘤复发和预后的判断有重要意义，而且对指导临床治疗也有很大价值。而目前临床肿瘤的发现和诊断仍高度依赖于影像学及血清肿瘤标志物的检查，难以早期发现肿瘤的转移或复发，也难以及时反映疗效。因此，现有肿瘤常规筛查、诊断方法不能满足临床需求，临床迫切需要安全、准确性高、操作方便的癌症筛查、诊断新方法。血液中循环肿瘤细胞以较低的数量存在于血液中，一般需要富集后才能有效检测和分析。血液中的细胞种类繁多，要绝对准确地鉴定血液中的肿瘤细胞，并不容易。CTC在肿瘤患者外周血中极为稀少，约1～10个/mL，而正常成人外周血中所有血细胞浓度为109/mL，白细胞的浓度是4～10×106/mL。远低于血液中其他类型细胞数量的稀缺性使得CTC在血液检测中极具挑战性。CTC检测一般包括CTC富集和CTC鉴定两个部分，通常要通过富集的步骤以去除大部分正常细胞，然后再鉴定得到的细胞的确是CTC。CTC的富集方法主要分为物理方法和生物化学方法两大类。CTC的鉴定主要通过细胞形态学或核酸分子水平进行分析鉴定。CTC的富集方法主要分为物理方法和生物化学方法两大类。物理法基于肿瘤细胞与正常细胞物理性质，如大小、变形性、密度、介电性等的差异，利用外力场比如磁场，流体场，电场等的作用进行分离捕获。生物化学法通常依赖于细胞膜表面的抗原与偶联在分离介质上的抗体相结合，达到分离捕获的目的。现阶段应用于CTC的富集技术主要包括：基于细胞密度的离心法、基于细胞体积的滤膜过滤法(isolationbysizeofepithelialtumourcells，ISET)、免疫磁珠法(magneticactivatedcellsorting,MACS)、CTC-Chip微流控芯片技术等。现有密度梯度离心法特异性低、敏感性低、回收率低、稳定性低，不仅容易造成肿瘤细胞丢失，且依赖于肿瘤细胞的特性、离心的时间、温度等多种因素，作为单一的CTC分离手段未来发展潜力十分有限。ISET法虽然操作简便、价格低廉、通量高，可同时大批量处理样本，耗时较短，但存在缺乏特异性、肿瘤细胞被漏检(≦8um)的可能，同样不可能成为未来的发展趋势与潮流。CTC当前循环肿瘤细胞富集应用最广发的是阳性富集的方法，包括免疫磁珠法阳性富集、微流控芯片法阳性富集。微流控芯片应用于稀有细胞分选的不足主要表现在耗时长、效果差、细胞活性受损三个方面。此外，通量和纯度在大多数芯片中往往是互相制约的两个指标，通量上升则意味着纯度下降，反之亦然，如何兼顾两者是微流控分选技术发展的又一挑战。最后，考虑到捕获到的细胞可能含有不同的亚型，或是同一类细胞的不同生长阶段，后续的表型分析对临床诊断具有重要意义，这对捕获细胞的活性提出了较高的要求。但是，微通道中微结构的挤压，高剪切流的流场，外加的电场、声场等都会对细胞的活性造成一定的损伤，对后续分析造成困扰。申请号为201110161224.7的中国专利公开了一种定量分析循环肿瘤细胞的试剂及试剂盒，通过设计适宜检测循环肿瘤细胞的探针，从而可配合流式细胞技术，获得循环肿瘤细胞的测定结果。免疫磁珠法是目前应用最为广泛的CTC分离方法，主要是指阳性富集法，具有简便易行、分离纯度高的优点，但回收率低、存在漏检的缺陷也非常明显。目前，大量的免疫磁珠法CTC研究根据肿瘤的上皮抗原进行分离，并且认为EpCAM是目前最优的肿瘤生物标记物，但有研究表明大多数恶性肿瘤的CTC会丢失EpCAM抗原。这就意味着这种方法有可能会漏检具有侵害性的CTC。事实上，研究发现134种组织类型不同的肿瘤细胞只有70％表达EpCAM，但存在表达强度不一的差异性。目前，尚没有一种100％特异性的肿瘤生物标记物。但循环肿瘤细胞阳性富集方法存在着CTC特异性标志物缺乏、单克隆抗体筛选困难、回收率低、存在漏检(抗体无法识别的肿瘤细胞被忽略)等缺点，影响检测结果。由于CTC缺乏特异性的标志物，目前普遍采用EpCAM(上皮细胞粘附分子)磁珠标记并分离CTC，基于这一原理发展起来的CellSearch等仪器已经投入市场运作。然而，该方法无法检出低表达和不表达EpCAM的CTC。已有研究指出，基于这一原理分离CTC将低估其数量并丢失具有高转移及增殖潜力的CTC亚群。一个典型的例子就是，发生上皮-间质转化(EMT)的CTC低表达或不表达EpCAM亚群因为具有高的迁移力而被认为是造成转移的最主要原因之一。与免疫磁珠阳性富集方法相比，CTC免疫磁珠阴性富集方法具有更多的优势。该技术利用结合有CD45单克隆抗体的免疫磁珠特异性结合白细胞表面的CD45抗原(白细胞共同抗原)，对白细胞进行磁性标记，通过外加磁场去除白细胞，从而可以不依赖CTC表面标记物，把CTC所有亚群、全部类型富集出来。CTC免疫磁珠阴性富集技术在分离出全部类型的CTC上具有技术优势，同时由于不依赖于CTC表面标记物，预期可用于所有类型实体瘤的CTC富集。因此，开发不依赖于CTC表面标记物的分离方法是一个具有巨大前景的技术方向。另一方面，阴性富集策略的免疫磁珠法通过有效去除CD45+的白细胞或CD61+的巨噬细胞、血小板等外周血其他细胞而间接富集稀有上皮细胞，某种程度上克服了EMT导致的EpCAM阳性富集策略的缺陷。此外，通过阴性富集策略得到的循环肿瘤细胞还具有没有经过任何标记、高细胞活性等优势。综上所述，现经报道的多种CTC分离方法虽然各自具有独特的检测优势，但仍本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将密度梯度分离液和肿瘤患者血样在淋巴细胞分离管中混合，加入洗涤缓冲液，进行第一次离心；S2：将经过第一次离心的淋巴细胞分离管中挡板上层溶液转移至第一离心管中，进行第二次离心，吸去上清，加入红细胞裂解液，静置；S3：将经过静置后的第一离心管进行第三次离心，吸去上清，加入磁珠孵育缓冲液，再加入阴性富集免疫磁珠，混匀，孵育20‑40min，所述阴性富集免疫磁珠结合有靶向白细胞表面广谱标记物CD45；S4：将上述经过孵育后的第一离心管放置在磁力架上静置，将上清液全部转移至第二离心管中，用洗涤缓冲液冲洗第二离心管；S5：将上述第二离心管进行第四次离心，吸去第二离心管上清液，在第二离心管中加入细胞固定液重悬后涂于载玻片上，过夜干燥，得到干燥的循环肿瘤细胞。

【技术特征摘要】
1.一种循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将密度梯度分离液和肿瘤患者血样在淋巴细胞分离管中混合，加入洗涤缓冲液，进行第一次离心；S2：将经过第一次离心的淋巴细胞分离管中挡板上层溶液转移至第一离心管中，进行第二次离心，吸去上清，加入红细胞裂解液，静置；S3：将经过静置后的第一离心管进行第三次离心，吸去上清，加入磁珠孵育缓冲液，再加入阴性富集免疫磁珠，混匀，孵育20-40min，所述阴性富集免疫磁珠结合有靶向白细胞表面广谱标记物CD45；S4：将上述经过孵育后的第一离心管放置在磁力架上静置，将上清液全部转移至第二离心管中，用洗涤缓冲液冲洗第二离心管；S5：将上述第二离心管进行第四次离心，吸去第二离心管上清液，在第二离心管中加入细胞固定液重悬后涂于载玻片上，过夜干燥，得到干燥的循环肿瘤细胞。2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，还包括步骤：S6：利用多色免疫荧光技术对干燥的循环肿瘤细胞进行鉴定并荧光计数。3.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，所述S1具体为：在淋巴细胞分离管中加入密度梯度分离液，瞬时离心使密度梯度分离液全部离心到管底；在装有密度梯度分离液的淋巴细胞分离管中加入3mL的肿瘤患者血样，并加入大于3mL的洗涤缓冲液，进行第一次离心，所述第一次离心的条件为25℃、800g/15min。4.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，所述S2具体为：将上述经过第一次离心的淋巴细胞分离管中挡板上层溶液转移至第一离心管中，进行第二次离心，所述第二次离心的条件为25℃、300g/10min，吸去上清，加入5mL的红细胞裂解液，静置5min。5.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，所述S3具体为：将经过静置后的第一离心管进行第三次离心，所述第三次离心的条件为25℃、300g/10min，吸去上清，加入5mL磁珠孵育缓冲液，再加入200uL阴性富集免疫磁珠，吹打混匀，于4℃低速垂直混匀，孵育30min，所述阴性富集免疫磁珠结合有靶向白细胞表面广谱标记物CD45。6.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：任晓辉，黄慧玲，杨昂，刘晶晶，李印淑，张磊，
申请(专利权)人：亚能生物技术深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44