一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法技术

本发明专利技术公开了一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，该分离和培养方法包括以下步骤：新生儿新鲜的离体脐带→低温PBS液保存、冲洗→低温浸泡液中剪切→低温PBS液冲洗，低温真空处理→解冻→加入PBS液浸润→加入第一混合酶溶液，振荡酶解处理→加入第二混合酶溶液，振荡酶解处理→加入胎牛血清、PBS液、LG‑DMEM培养基，静置后离心，弃上清→加入PBS液，静置后离心，弃上清→加入胎牛血清、PBS液、LG‑DMEM培养基，静置后离心，弃上清→加入胎牛血清、PBS液、LG‑DMEM培养基，混匀→扩增培养；具有提高脐带间充质干细胞纯度的效果。

Method for separating and culturing human umbilical cord mesenchymal stem cells

The invention discloses a human umbilical cord mesenchymal stem cells were isolated and cultured, the isolation and culture method comprises the following steps: newborn fresh isolated umbilical cord, low temperature preservation in PBS solution, washing, cutting, low temperature soaking liquid of low temperature PBS washing liquid, vacuum treatment, thawing, adding PBS to adding liquid infiltration the first mixed enzyme solution at low temperature, enzyme treatment, oscillation added second mixed enzyme solution, oscillation enzyme treatment to adding fetal bovine serum, PBS, LG liquid DMEM medium, static after centrifugation, supernatant liquid, adding PBS, static after centrifugation, supernatant, fetal bovine serum, PBS, liquid LG DMEM medium, static after centrifugation, supernatant, fetal bovine serum, PBS, LG DMEM liquid medium, mixing and amplification culture; with increase of umbilical cord mesenchymal stem cells purity effect.

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法
本专利技术涉及间充质干细胞的制备技术，特别涉及一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，其可在体外适宜条件下连续传代培养、冻存。由于MSCs在特定条件下可分化为不同细胞，故其逐渐成为细胞治疗和基因治疗领域中极具实用价值的细胞来源。脐带属于胚胎外组织，其含有大量多向分化的干细胞，细胞生长扩增速度快，且脐带在胎儿娩出后成为“废弃物”，所以取材方便，来源丰富，更无伦理学问题，可作为极佳的间充质干细胞来源。公开号为CN101643719A、公开日为2010年2月10日的中国专利公开了一种简化的脐带间充质干细胞分离培养方法，该方法包括下述步骤：脐带去除生理盐水清洗→剪切→离心弃上清→组织块用10％αMEM培养，每3天换液→至10天左右细胞达80％左右融合时传代→以后每隔3-5天传代一次。在细胞表型鉴定研究发现，通过这种方法分离培养得到的脐带间充质干细胞纯度仍有待提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，具有提高脐带间充质干细胞纯度的效果。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：i.取新生儿新鲜的离体脐带，将其置于控温为2～5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液中，保存待用；ii.取出经步骤i处理的脐带，用控温为2～5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液多次冲洗，至无血迹残留；iii.在控温为2～5℃的浸泡液环境中，剪切洗涤后的脐带，剪切过程中剔除动静脉；所述脐带和浸泡液的用量比为1g:10～20ml，所述浸泡液包括0.9～1.0g/L的葡萄糖、10～20g/L的乙醇，余量为水；iv.取剪切后的脐带，用控温为2～5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液冲洗2～3次，将其放入培养瓶后置于控温为-80～-70℃且控真空度为10～30Pa的环境下5～20min，除去脐带上的溶剂；v.取培养瓶密封处理，将其置于控温为-40～-35℃的环境中，待培养瓶的温度升至-40～-35℃时则将培养瓶转移至控温为-5～0℃的环境中，待培养瓶的温度升至-5～0℃时则将培养瓶转移至控温为37℃的环境中，至其内的脐带解冻完全；vi.取经步骤v处理的培养瓶，于其内加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液；其中所述脐带和PBS液的用量比为1g:0.5～1ml，振荡1～5min使脐带和PBS液充分接触；vii.取经步骤vi处理的培养瓶，于其内加入第一混合酶溶液，振荡处理，振荡用的水浴控温曲线为：0-5min，15℃恒温→5.01-20min，匀速升温至25℃→20.01-30min，25℃恒温→30.01-40min，匀速升温至37℃→40.01-75min，37℃恒温→75.01-90min，自然冷却至25℃；其中所述脐带和第一混合酶溶液的用量比为1g:2～5ml，所述第一混合酶溶液包括1～2mg/g的胰蛋白酶-EDTA消化液、2～3mg/g的胶原酶II、5～10mg/g的乙醇，余量为水；viii.取经步骤vii处理的培养瓶，于其内加入第二混合酶溶液，振荡处理，振荡用的水浴控温曲线为：0-2min，25℃恒温→2.01-10min，匀速升温至30℃→10.01-15min，30℃恒温→15.01-20min，匀速升温至37℃→20.01-60min，37℃恒温→60.01-75min，自然冷却至25℃；其中所述脐带和第二混合酶溶液的用量比为0.5g:2～5ml，所述第二混合酶溶液包括0.5～1mg/g的胶原酶II、0.5～1mg/g透明质酸酶、0.2～0.5mg/g的DNA水解酶、2～5mg/g的乙醇，余量为水；IX.取经步骤viii处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和0.1g/L链霉素的LG-DMEM培养基，于20～25℃下静置2～5min并在此温度下离心5～8min；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.2～0.5ml:1～2ml:2～5ml；X.取经步骤IX处理的培养瓶，加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液，于20～25℃下静置2～5min并在此温度下离心5～8min，弃上清；其中所述脐带和PBS液用量比为1g:2～5ml；XI.取经步骤X处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基，于20～25℃下静置2～5min并在此温度下离心5～8min，弃上清，重复2～3次；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.5～1ml:2～5ml:2～5ml；XII.取经步骤XI处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基，混匀；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.5ml:1ml:1ml；XIII.取经步骤XII处理后的样品的100μL样品，向其加入0.5ml的胎牛血清、12ml的DMEM/F12培养基和1mgNaCl，置于37℃、体积分数为5％的CO2、湿度为95％RH的环境中静置培养；4天后换液，去除未贴壁细胞，以后每2天更换一次；待培养皿中的细胞达到80％融合，弃去培养液，PBS漂洗1次后，加37℃、胰蛋白酶-EDTA消化液消化2min，轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基终止消化，收集吹打后所得细胞，离心，弃上清，用加入0.5ml的胎牛血清、12ml的DMEM/F12培养基和1mgNaCl重新混匀，1∶2的比例进行传代接种，置于37℃、体积分数5％CO2、湿度为95％RH的环境中静置培养，每2天更换一次换液1次，待培养皿中的原代干细胞达到80％融合用同样方法消化传代。细胞表型鉴定研究发现，上述技术方案在扩增培养时，其细胞达80％融合时间可缩减至5天以内，增加了其培养速度；且其鼠抗人PE标记的CD73(作为间充质干细胞的标志性抗原)阳性率提高至91％以上，提高了间充质干细胞纯度，产品品质得到提高。进一步优选为：经步骤i处理后的脐带在48hr以内用步骤ii处理。进一步优选为：步骤iii中，脐带剪成1mm×1mm×1mm大小。进一步优选为：步骤iii中，所述浸泡液还包括0.2～0.5g/L的L-谷氨酸。进一步优选为：所述浸泡液包括1.0g/L的葡萄糖、0.4g/L的L-谷氨酸、18g/L的乙醇，余量为水。进一步优选为：步骤vi中，所述脐带和PBS液的用量比为1g：1ml。进一步优选为：步骤vii中，所述脐带和第一混合酶溶液的用量比为1g:4m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，其特征在于，包括以下步骤：i.取新生儿新鲜的离体脐带，将其置于控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液中，保存待用；ii.取出经步骤i处理的脐带，用控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液多次冲洗，至无血迹残留；iii.在控温为2~5℃的浸泡液环境中，剪切洗涤后的脐带，剪切过程中剔除动静脉；所述脐带和浸泡液的用量比为1g:10~20ml，所述浸泡液包括0.9~1.0g/L的葡萄糖、10~20g/L的乙醇，余量为水；iv.取剪切后的脐带，用控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液冲洗2~3次，将其放入培养瓶后置于控温为‑80~‑70℃且控真空度为10~30Pa的环境下5~20min，除去脐带上的溶剂；v.取培养瓶密封处理，将其置于控温为‑40~‑35℃的环境中，待培养瓶的温度升至‑40~‑35℃时则将培养瓶转移至控温为‑5~0℃的环境中，待培养瓶的温度升至‑5~0℃时则将培养瓶转移至控温为37℃的环境中，至其内的脐带解冻完全；vi.取经步骤v处理的培养瓶，于其内加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液；其中所述脐带和PBS液的用量比为1g:0.5~1ml，振荡1~5min使脐带和PBS液充分接触；vii.取经步骤vi处理的培养瓶，于其内加入第一混合酶溶液，振荡处理，振荡用的水浴控温曲线为：0‑5min，15℃恒温→5.01‑20min，匀速升温至25℃→20.01‑30min，25℃恒温→30.01‑40min，匀速升温至37℃→40.01‑75min，37℃恒温→75.01‑90min，自然冷却至25℃；其中所述脐带和第一混合酶溶液的用量比为1g:2~5ml，所述第一混合酶溶液包括1~2mg/g的胰蛋白酶‑EDTA消化液、2~3mg/g的胶原酶II、5~10mg/g的乙醇，余量为水；viii.取经步骤vii处理的培养瓶，于其内加入第二混合酶溶液，振荡处理，振荡用的水浴控温曲线为：0‑2min，25℃恒温→2.01‑10min，匀速升温至30℃→10.01‑15min，30℃恒温→15.01‑20min，匀速升温至37℃→20.01‑60min，37℃恒温→60.01‑75min，自然冷却至25℃；其中所述脐带和第二混合酶溶液的用量比为0.5g:2~5ml，所述第二混合酶溶液包括0.5~1mg/g的胶原酶II、0.5~1mg/g透明质酸酶、0.2~0.5mg/g的DNA水解酶、2~5mg/g的乙醇，余量为水；IX.取经步骤viii处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和0.1g/L链霉素的LG‑DMEM培养基，于20~25℃下静置2~5min并在此温度下离心5~8min；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG‑DMEM培养基的用量比为1g:0.2~0.5 ml:1~2ml:2~5ml；X.取经步骤IX处理的培养瓶，加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液，于20~25℃下静置2~5min并在此温度下离心5~8min，弃上清；其中所述脐带和PBS液用量比为1g:2~5ml；XI.取经步骤X处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG‑DMEM培养基，于20~25℃下静置2~5min并在此温度下离心5~8min，弃上清，重复2~3次；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG‑DMEM培养基的用量比为1g:0.5~1ml:2~5ml:2~5ml；XII.取经步骤XI处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG‑DMEM培养基，混匀；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG‑DMEM培养基的用量比为1g:0.5ml:1ml:1ml；XIII. 取经步骤XII处理后的样品的100μL样品，向其加入0.5ml的胎牛血清、12ml的DMEM/F12培养基和1mg NaCl，置于37℃、体积分数为5%的CO...

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，其特征在于，包括以下步骤：i.取新生儿新鲜的离体脐带，将其置于控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液中，保存待用；ii.取出经步骤i处理的脐带，用控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液多次冲洗，至无血迹残留；iii.在控温为2~5℃的浸泡液环境中，剪切洗涤后的脐带，剪切过程中剔除动静脉；所述脐带和浸泡液的用量比为1g:10~20ml，所述浸泡液包括0.9~1.0g/L的葡萄糖、10~20g/L的乙醇，余量为水；iv.取剪切后的脐带，用控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液冲洗2~3次，将其放入培养瓶后置于控温为-80~-70℃且控真空度为10~30Pa的环境下5~20min，除去脐带上的溶剂；v.取培养瓶密封处理，将其置于控温为-40~-35℃的环境中，待培养瓶的温度升至-40~-35℃时则将培养瓶转移至控温为-5~0℃的环境中，待培养瓶的温度升至-5~0℃时则将培养瓶转移至控温为37℃的环境中，至其内的脐带解冻完全；vi.取经步骤v处理的培养瓶，于其内加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液；其中所述脐带和PBS液的用量比为1g:0.5~1ml，振荡1~5min使脐带和PBS液充分接触；vii.取经步骤vi处理的培养瓶，于其内加入第一混合酶溶液，振荡处理，振荡用的水浴控温曲线为：0-5min，15℃恒温→5.01-20min，匀速升温至25℃→20.01-30min，25℃恒温→30.01-40min，匀速升温至37℃→40.01-75min，37℃恒温→75.01-90min，自然冷却至25℃；其中所述脐带和第一混合酶溶液的用量比为1g:2~5ml，所述第一混合酶溶液包括1~2mg/g的胰蛋白酶-EDTA消化液、2~3mg/g的胶原酶II、5~10mg/g的乙醇，余量为水；viii.取经步骤vii处理的培养瓶，于其内加入第二混合酶溶液，振荡处理，振荡用的水浴控温曲线为：0-2min，25℃恒温→2.01-10min，匀速升温至30℃→10.01-15min，30℃恒温→15.01-20min，匀速升温至37℃→20.01-60min，37℃恒温→60.01-75min，自然冷却至25℃；其中所述脐带和第二混合酶溶液的用量比为0.5g:2~5ml，所述第二混合酶溶液包括0.5~1mg/g的胶原酶II、0.5~1mg/g透明质酸酶、0.2~0.5mg/g的DNA水解酶、2~5mg/g的乙醇，余量为水；IX.取经步骤viii处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和0.1g/L链霉素的LG-DMEM培养基，于20~25℃下静置2~5min并在此温度下离心5~8min；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.2~0.5ml:1~2ml:2~5ml；X.取经步骤IX处理的培养瓶，加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液，于20~25℃下静置2~5min并在此温度下离心5~8min，弃上清；其中所述脐带和PBS液用量比为1g:2~5ml；XI.取经步骤X处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基，于20~25℃下静置2~5min并在此温度下离心5~8min，弃上清，重复2~3次；其中所述脐带...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈继冰，吴振化，
申请(专利权)人：浙江译美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33