成纤维细胞的培养基及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种诱导性多能干细胞诱导成成纤维细胞的培养基及其制备方法。该培养基包括基础培养液和添加物，所述基础培养液为体积比为1:0.5～2的H‑DMEM培养液和F12培养液；以在所述基础培养液中的浓度计，所述添加物包括如下组分：非必须氨基酸、谷氨酰胺衍生物、胰岛素、氢化可的松、转铁蛋白、亚硒酸钠、成纤维细胞生长因子、雌二醇、黄体酮、8‑溴环磷腺苷、人卵泡刺激素。该培养基能够获得较现有技术更高的成纤维细胞分化概率，并且能够稳定传代，提高细胞的增殖速度，为皮肤组织工程提供成纤维细胞的种子细胞来源，同时整个过程没有用到血清，有效的避免了动物源性病原体带来的风险，提高了临床应用的安全性。

Culture medium of fibroblast and preparation method thereof

The invention relates to a culture medium for induction of pluripotent stem cells into fibroblasts and a preparation method thereof. The culture medium containing basic culture fluid and additives, liquid culture the foundation for the volume ratio of 1:0.5 to 2 H DMEM medium and F12 medium; with the concentration in the culture solution in the base, the additive comprises the following components: non essential amino acid, glutamine derivatives, insulin, hydrocortisone, transferrin, sodium selenite, fibroblast growth factor, estradiol, progesterone, 8 bromo adenosine cyclophosphate, human follicle stimulating hormone. The culture medium can obtain the probability of fiber cell differentiation into higher than the existing technology, and can improve the stable passage, cell proliferation, skin tissue engineering with fibroblast source of seed cells, and the whole process is not used in serum, effectively avoid the risk of animal pathogens, improve safety clinical application.

【技术实现步骤摘要】
成纤维细胞的培养基及其制备方法
本专利技术涉及细胞培养基，特别是涉及一种成纤维细胞的培养基及其制备方法。
技术介绍
皮肤组织工程是近几年的研究热点。但是皮肤的相关细胞都属于终末分化细胞，很难在体外进行大规模的培养扩增，同时种子细胞的来源问题也阻碍了皮肤组织工程的发展。由于自体的种子细胞来源有限，异体的种子细胞存在排斥反应，干细胞又存在伦理问题，因此从尿液中收集尿液细胞，将尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞(ips细胞)，ips细胞再诱导成为角质形成细胞、成纤维细胞、汗腺细胞、毛乳头细胞等，即可解决皮肤组织工程的种子来源问题，且从尿液中获得细胞，方便快捷，不用通过创伤获取，来源广泛。但是，目前的采用的将ips细胞诱导成为成纤维细胞的培养基，如MEF培养基的分化概率较低，难以满足实际需求，且含有血清，会带来动物源性病原体风险，影响临床应用的安全性。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种不含血清，安全性高，且提高诱导性多能干细胞向成纤维细胞分化比例的成纤维细胞的培养基。一种成纤维细胞的培养基，包括基础培养液和添加物，所述基础培养液为体积比为1:0.5～2的H-DMEM培养液和F12培养液；以在所述基础培养液中的添加量计，所述添加物包括如下组分：在其中一个实施例中，所述添加物包括如下组分：在其中一个实施例中，所述添加物还包括抗生素。在其中一个实施例中，所述抗生素包括在所述基础培养液中添加量为0.05～0.2mg/mL的青霉素以及在所述基础培养液中添加量为0.05～0.2mg/mL的链霉素。在其中一个实施例中，所述添加物还包括自由基清除剂。在其中一个实施例中，所述自由基清除剂为在所述基础培养液中添加量为0.05～0.2mmol/L的β-巯基乙醇。本专利技术还提供所述的成纤维细胞的培养基的制备方法，包括如下步骤：按所述体积比混合H-DMEM培养液和F12培养液，得所述基础培养液；将所述胰岛素、氢化可的松、转铁蛋白、亚硒酸钠、非必需氨基酸、谷氨酰胺衍生物、成纤维细胞生长因子、雌二醇、黄体酮、8-溴环磷腺苷，人卵泡刺激素添加至所述基础培养液中，即可。本专利技术还提供所述的成纤维细胞的培养基在成纤维细胞培养中的应用。本专利技术还提供一种将诱导性多能干细胞诱导为成纤维细胞的方法，包括如下步骤：采用mTeSR1培养基对诱导性多能干细胞进行培养，当汇合度为75～85％时，消化为单细胞；取适量所述单细胞，以EB拟胚体形成培养基进行培养，形成拟胚体；将所述拟胚体接种至所述培养基中培养，即得成纤维细胞。在其中一个实施例中，所述拟胚体的培养条件为：采用CO2浓度为5～7％，温度为37℃的培养箱培养24～50h。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的成纤维细胞的培养基，在H-DMEM和F12培养液的基础上，添加特定的添加物，其中，碱性成纤维细胞因子是一种能促进中胚层和神经外胚层细胞分裂的多肽，和胰岛素、氢化可的松、转铁蛋白、亚硒酸钠、非必需氨基酸、谷氨酰胺衍生物、成纤维细胞生长因子、雌二醇、黄体酮、8-溴环磷腺苷重新组成一种组合物主要是传递发育信号的作用，能促进拟胚体的中胚层细胞分化为成纤维细胞。由此本专利技术的成纤维细胞的培养基能够实现提高诱导性多能干细胞向成纤维细胞分化的比例，并且能够稳定传代，提高细胞的增殖速度，为皮肤组织工程提供成纤维细胞的种子细胞来源。同时整个过程没有用到血清，有效的避免了动物源性病原体带来的风险，提高了临床应用的安全性。该培养基还可以通过添加特定的抗生素和自由基清除剂，有效抑制培养过程中细菌的产生并清除积累的氧自由基，以维持较优的培养环境，提高细胞的成活率。附图说明图1为本专利技术实施例的实验组和对比组出现细胞形变所需天数的对比图；图2为显微镜下观察实验组和对比组的免疫荧光I型胶原的表达；图3为实施例1中实验组和对比组中的成纤维细胞增值速度比较；图4为实施例2中实验组和对比组中的成纤维细胞增值速度比较；图5为实施例3中实验组和对比组中的成纤维细胞增值速度比较。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术的成纤维细胞的培养基及其制备方法作进一步详细的说明。本专利技术实施例中采用的H-DMEM培养液、F12培养液、mTeSR1培养基、EB拟胚体形成培养基均为市售产品。实施例1一、设计实验组和对照组：1.实验组培养基：实验组培养基包括基础培养液和添加物，所述基础培养液为体积比为1:1的H-DMEM培养液和F12培养液，总体积为500mL；以在所述基础培养液中的添加量计，所述添加物包括如下组分：配制方法：按照上述比例在500mL基础培养液中加入胰岛素30mg，氢化可的松0.2mg，转铁蛋白50mg，亚硒酸钠5μg，β-巯基乙醇0.05mmoL，NEAA5mL，GlutaMAX5mL，青霉素50mg，链霉素50mg，bFGF7.5μg，E25nmoL，P40.5mmoL，8-溴-cAMP0.5mmoL，人卵泡刺激素FSH50nmoL，即可。2.对照组培养基对照组采用现有的MEF培养液500mL，并在其中加入10mLFBS。二、体外诱导ips向成纤维细胞分化(1)复苏细胞：选择P30的ips细胞进行复苏，然后用mTeSR1培养基进行培养，当达到80％汇合度时，用Accutase消化液消化为单细胞，计数。(2)简单拟胚体的形成：每个AggreWellTM800培养板孔中加入1×106个上述单细胞，然后加入EB增菌液形成培养基，按产品使用操作手册，将AggreWellTM800培养板低速离心700r/min，5min，放入5％CO2，37℃培养箱中培养，培养48h后形成简单拟胚体。(3)诱导分化：将形成简单拟胚体转移至低吸附24孔板中，24孔板分为两组，实验组和对照组，每组12孔，实验组用实验组培养基培养，对照组用对照组培养基培养，隔天换液，记录第几天细胞出现变形(结果如图1所示)。挑出变形细胞团，用免疫荧光方法鉴定成纤维细胞，确定形变的细胞为成纤维细胞后再连续培养，每次传代都进行细胞计数，比较细胞的增殖速度。三、成纤维细胞的鉴定用免疫荧光鉴定成纤维细胞I型胶原的抗原表达：1.诱导15天后，实验组、对照组分别将培养基弃去，用PBS洗三遍，每次5min。2.每孔加入4％多聚甲醛1mL固定1h，用PBS洗三遍，每次5min。3.0.1％Triton破膜10min，用PBS洗三遍，每次5min。4.弃去PBS，实验组、对照组分别加入兔抗人I型胶原(1：50)500μl，4℃湿盒孵育过夜。5.用PBS洗三遍，每次5min。实验组、对照组分别加入二抗羊抗兔抗IgG(1:200)500μL，室温避光孵育1h。6.用PBS洗三遍，每次5min。7.50％甘油封片，荧光显微镜下观察，结果如图2所示，同时对发出荧光的细胞进行计数，结果如图3所示。实施例2本实施例一种诱导性多能干细胞诱导成成纤维细胞的方法，其方法同实施例1中的步骤二，区别在于：采用的培养基包括基础培养液和添加物，所述基础培养液为体积比为1:2的H-DMEM培养液和F12培养液，总体积为500mL；以在所述基础培养液中的浓度计，所述添加物包括如下组分：成分名称工作浓度NEAA0.5％v/vGlutaMAX2％v/v胰岛素1μg/mL氢化可的松1μg/mL转铁蛋白150μg/mL亚硒酸钠5ng/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种成纤维细胞的培养基，其特征在于，包括基础培养液和添加物；所述基础培养液为体积比为1:0.5～2的H‑DMEM培养液和F12培养液；以在所述基础培养液中的添加量计，所述添加物包括如下组分：

【技术特征摘要】
1.一种成纤维细胞的培养基，其特征在于，包括基础培养液和添加物；所述基础培养液为体积比为1:0.5～2的H-DMEM培养液和F12培养液；以在所述基础培养液中的添加量计，所述添加物包括如下组分：2.根据权利要求1所述的成纤维细胞的培养基，其特征在于，以在所述基础培养液中的添加量计，所述添加物包括如下组分：3.根据权利要求1或2所述的成纤维细胞的培养基，其特征在于，所述添加物还包括抗生素。4.根据权利要求3所述的成纤维细胞的培养基，其特征在于，所述抗生素包括在所述基础培养液中添加量为0.05～0.2mg/mL的青霉素以及在所述基础培养液中添加量为0.05～0.2mg/mL的链霉素。5.根据权利要求1或2所述的成纤维细胞的培养基，其特征在于，所述添加物还包括自由基清除剂。6.根据权利要求5所述的成纤维细胞的培养基，其特征在于，所述自由基清除剂为在所述基础培养液中添加量为0.05～0.2mmol/L的β-巯基乙醇。7.权利要求1-6任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：车七石，
申请(专利权)人：广州润虹医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44