一种从瘤胃液中获得硝酸盐还原菌的方法技术

本发明专利技术涉及一种从瘤胃液中获取硝酸盐还原菌的方法，属于微生物研究技术领域。本发明专利技术方法包括制备瘤胃硝酸盐还原菌纯培养发酵液、制备富集培养液、接种培养的步骤。本发明专利技术利用选择性培养基，特定去氧剂，可实现每毫升含活菌数达≥10

A method for obtaining nitrate reducing bacteria from rumen fluid

The invention relates to a method for obtaining nitrate reducing bacteria from tumor gastric juice, belonging to the technical field of microbial research. The method of the invention comprises the steps of preparing rumen nitrate reducing bacteria, pure culture fermentation liquid, preparing concentrated culture medium and inoculating culture. The present invention by selective medium, specific deoxidater, can realize the number of live bacteria per ml = 10

【技术实现步骤摘要】
一种从瘤胃液中获得硝酸盐还原菌的方法
本专利技术涉及一种从瘤胃液中获取硝酸盐还原菌的方法，属于微生物研究

技术介绍
目前报道的具有还原硝酸盐能力的瘤胃厌氧细菌包括反刍兽新月单胞菌(Selenomonasruminantium)、韦荣氏球菌(Veillonellaparvula)、产琥珀酸沃廉氏菌(Wolinellasuccinogenes)、弯曲杆菌(Campylobacterfetus)和曼海姆产琥珀酸菌(Mannheimiasucciniciproducens)。其中，反刍兽新月单胞菌是优势菌，在瘤胃中的数量最多，是最主要的瘤胃硝酸盐还原菌。硝酸盐在瘤胃内可以提供氮，并降低甲烷的排放量，而这个过程需要硝酸盐还原菌的参与，因此，如何培养获得硝酸盐还原菌，并进行深入研究，是该领域需要解决的重点问题。目前对于硝酸盐还原菌的培养研究和报道，大多数集中在土壤和水体中，同时多使用牛肉膏蛋白胨培养基MRS(马莎莎等，2011，化学与生物工程28(4)：32-35)。土壤和水体中的硝酸盐还原菌通常将硝酸盐还原成N2和N2O；而瘤胃中的硝酸盐还原菌通常将硝酸盐还原成氨态氮，被微生物再利用合成菌体蛋白。可见，瘤胃硝酸盐还原菌具有其特殊性。同时，瘤胃硝酸盐还原菌必须在厌氧的条件下才能繁殖，而使用Na2S作为去氧溶剂，易导致菌液出现黑色颗粒，或灭菌后出现絮状沉淀等问题，影响菌的纯度和生长，并且生长的温度与土壤、水体的温度大不相同。目前沿用土壤或水体的培养方法，无法得到瘤胃硝酸盐还原菌。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种瘤胃硝酸盐还原菌的制备方法，具体为利用选择性培养基，特定去氧剂，获得瘤胃硝酸盐还原菌的方法。本专利技术所述的瘤胃硝酸盐还原菌的制备方法，包括以下步骤：(1)制备瘤胃硝酸盐还原菌纯培养发酵液首先配制基础培养基：在超纯水中加入氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化锰、硫酸亚铁、氯化锌、氯化钴、酵母提取物、刃天青，其中超纯水与氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化锰、硫酸亚铁、氯化锌、氯化钴、酵母提取物、刃天青的质量比为100：110～130：10～12：8～10：3～5：2～4：1～2：0.3～0.5：19～23：19～23。待完全溶解后，2.5％半胱氨酸盐酸盐、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸，与上述溶液总体积的比例为1～2：0.18～0.19：0.06～0.07：0.015～0.018：0.015～0.018：0.015～0.018：0.015～0.018：100。用食碱调整pH为6.8～7.0，整个配制过程持续通入无氧CO2,在分装前加入2％的硝酸钾，待溶解后，按15ml体积，分装入50ml厌氧培养管，用丁基橡胶塞密封，铝盖封口后，在121～123℃温度条件下灭菌处理30分钟，冷却到38±1℃接入瘤胃液1～3ml，在39℃发酵20小时，制得对数期硝酸盐还原菌发酵液。将该菌液纯化转代培养至5～7代后，即可进行下一步富集培养。(2)制备富集培养液制备富集扩繁培养液，配方同(1)。将所有成分按相对比例加入厌氧发酵罐中，该罐内持续通入无氧CO240～60分钟。用蠕动泵以0.22μm滤膜负压过滤至灭菌后的空发酵瓶中，制备富集培养液。(3)将步骤(1)制备的对数期发酵液转入步骤(2)的富集培养液中，对数发酵液的加入量为5％(v/v)。通无氧CO2，接种后快速密封，与38±1℃培养，培养至20小时，达到对数生长期，此时每毫升含活菌数达≥106。本专利技术所述瘤胃硝酸盐还原菌的制备方法，避免了使用硫化钠可能产生的黑色沉淀颗粒，同时实现了菌的富集扩繁，提高了总菌含量，为科研提供材料。具体实施方式实施方式1(1)瘤胃液制备通过带有永久性瘤胃瘘管的成年山羊的瘤胃内，获取瘤胃食糜，以4层灭菌纱布过滤后，获得瘤胃液。(2)制备瘤胃硝酸盐还原菌纯培养发酵液首先配制基础培养基：在超纯水中加入氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化锰、硫酸亚铁、氯化锌、氯化钴、酵母提取物、刃天青，取100ml超纯水，分别加入110mg氯化钠、10mg氯化镁、8mg氯化钙、3mg氯化锰、2mg硫酸亚铁、1mg氯化锌、0.3mg氯化钴、19酵母提取物、19mg刃天青，待完全溶解后，再加入1ml2.5％半胱氨酸盐酸盐溶液，180μl乙酸，60μl丙酸，丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸各15μl。用食碱调整pH为6.9，整个配制过程持续通入无氧CO2,在分装前加入2.5g硝酸钾，待溶解后，按15ml体积，分装入50ml厌氧培养管，用丁基橡胶塞密封，铝盖封口后，在121℃温度条件下灭菌处理30分钟，冷却到38℃接入瘤胃液2ml，在39℃发酵20小时，制得对数期硝酸盐还原菌发酵液。将该菌液纯化转代培养至6代，即可进行下一步富集培养。(3)制备富集培养液制备富集扩繁培养液，配方同步骤(2)。将所有成分按相对比例加入厌氧发酵罐中，该罐内持续通入无氧CO250分钟。用蠕动泵以0.22μm滤膜负压过滤至灭菌后的培养瓶中，制备富集培养液。(4)富集培养将步骤(2)制备的对数期发酵液转入步骤(3)5富集培养液中，每100ml富集培养液加入5ml对数发酵液。通无氧CO2，接种后快速密封，与38℃培养，培养至20小时，此时每毫升含硝酸盐还原菌活菌数达≥106。实施方式2(1)瘤胃液制备通过带有永久性瘤胃瘘管的成年山羊的瘤胃内，获取瘤胃食糜，以4层灭菌纱布过滤后，获得瘤胃液。(2)制备瘤胃硝酸盐还原菌纯培养发酵液首先配制基础培养基：在超纯水中加入氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化锰、硫酸亚铁、氯化锌、氯化钴、酵母提取物、刃天青，取100ml超纯水中含有130mg氯化钠、12mg氯化镁、10mg氯化钙、5mg氯化锰、4mg硫酸亚铁、2mg氯化锌、0.5mg氯化钴、23mg酵母提取物、23mg刃天青。待完全溶解后，再加入2ml的2.5％半胱氨酸盐酸盐溶液，190μl乙酸，70μl丙酸，丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸各18μl。用食碱调整pH为7.0，整个配制过程持续通入无氧CO2,在分装前加入2.3g硝酸钾，待溶解后，按15ml体积，分装入50ml厌氧培养管，用丁基橡胶塞密封，铝盖封口后，在121℃温度条件下灭菌处理30分钟，冷却到38℃接入瘤胃液2ml，在39℃发酵20小时，制得对数期硝酸盐还原菌发酵液。将该菌液纯化转代培养至6代后，即可进行下一步富集培养。(3)制备富集培养液制备富集扩繁培养液，配方同(2)。将所有成分按相对比例加入厌氧发酵罐中，该罐内持续通入无氧CO240分钟。用蠕动泵以0.22μm滤膜负压过滤至灭菌后的培养瓶中，制备富集培养液。(4)富集培养将步骤(2)制备的对数期发酵液转入步骤(3)的富集培养液中，每100ml富集培养液加入5ml对数发酵液。通无氧CO2，接种后快速密封，与38±1℃培养，培养至20小时，此时每毫升含硝酸盐还原菌活菌数达≥106。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从瘤胃液中获得硝酸盐还原菌的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)制备瘤胃硝酸盐还原菌纯培养发酵液首先配制基础培养基：按超纯水：氯化钠：氯化镁：氯化钙：氯化锰：硫酸亚铁：氯化锌：氯化钴：酵母提取物：刃天青＝100：110～130：10～12：8～10：3～5：2～4：1～2：0.3～0.5：19～23：19～23的质量比在超纯水中加入各成分配制溶液；待完全溶解后，加入2.5％半胱氨酸盐酸盐、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸，它们与上述溶液总体积的体积比例为1～2：0.18～0.19：0.06～0.07：0.015～0.018：0.015～0.018：0.015～0.018：0.015～0.018：100；用食碱调整pH为6.8～7.0，整个配制过程持续通入无氧CO

【技术特征摘要】
1.一种从瘤胃液中获得硝酸盐还原菌的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)制备瘤胃硝酸盐还原菌纯培养发酵液首先配制基础培养基：按超纯水：氯化钠：氯化镁：氯化钙：氯化锰：硫酸亚铁：氯化锌：氯化钴：酵母提取物：刃天青＝100：110～130：10～12：8～10：3～5：2～4：1～2：0.3～0.5：19～23：19～23的质量比在超纯水中加入各成分配制溶液；待完全溶解后，加入2.5％半胱氨酸盐酸盐、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸，它们与上述溶液总体积的体积比例为1～2：0.18～0.19：0.06～0.07：0.015～0.018：0.015～0.018：0.015～0.018：0.015～0.018：100；用食碱调整pH为6.8～7.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：林淼，赵国琦，霍永久，贡笑笑，王梦琦，张蒙，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32