一种大肠杆菌利用柚皮素生物合成天然香橙素的方法技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌利用柚皮素生物合成天然香橙素的方法，属于发酵工程领域。本发明专利技术以一株产香橙素的基因工程菌株为出发菌株，利用葡萄糖和有机氮源获得较高菌体浓度，经过诱导剂诱导外源蛋白表达，最终实现香橙素的高效生物合成。本发明专利技术的生产方法可以实现天然香橙素的高效率生产，在发酵周期55h内，发酵液中香橙素浓度达到3～5g/L，底物质量转化率达70～90％。

A kind of Escherichia coli by naringenin biosynthesis of natural aromadendrin method

The present invention discloses a kind of Escherichia coli by naringenin biosynthesis of natural aromadendrin method, belonging to the field of fermentation engineering. The present invention by genetic engineering strain producing orange pigment as the starting strain, obtain high cell concentration using glucose and organic nitrogen source, after induction of exogenous protein expression, efficient biosynthesis of aromadendrin. The production method of the invention can realize natural aromadendrin efficient production in the fermentation period 55h, fermentation liquid aromadendrin concentration reached 3 ~ 5g/L, the quality of the substrate conversion rate of 70 ~ 90%.

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌利用柚皮素生物合成天然香橙素的方法
本专利技术涉及一种大肠杆菌利用柚皮素生物合成天然香橙素的方法，属于发酵工程领域。
技术介绍
香橙素(Aromadendrine)，又名二氢山萘酚(Dihydrokaempferol)是一种黄酮醇，属于黄酮类化合物，是植物花色苷的一种重要前体物质。香橙素第一次是从桃中发现的，此后陆续发现存在于不同植物中，如流苏树属的植物、酒神菊树、山羊树、侧柏叶和西伯利亚红松等，但在自然界分布并不广泛。黄酮类化合物已被广泛报道具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性，和神经保护活性。现在也已有多篇报道表明香橙素具有多种生物活性，如抗炎活性、清除自由基的活性和抗肿瘤活性。香橙素可以通过刺激葡萄糖吸收和改善胰岛素抗性而具有抗糖尿病活性，而高浓度的香橙素还可以减少小胶质细胞中脂多糖诱导的一氧化氮的产生。此外，香橙素衍生物具有多种生物活性，如抗增殖和成骨作用。因此，香橙素在医药、保健品和食品添加剂等方面有着广泛的用途。目前香橙素主要通过植物提取获得，但由于香橙素在植物中含量太低，需要消耗大量的植物原料，植物原料的获得、收集及储存都不方便，使得通过植物提取的香橙素成本较高。因此，为了满足工业大生产的要求，这就需要有一种新的技术来替代植物提取法生产香橙素，这种新方法操作起来要更简便、生产成本更低、生产率更高。而利用微生物发酵的生物合成法是实现上述要求的有效途径。目前为止，还未见以柚皮素为底物利用生物发酵法生产香橙素的报道。
技术实现思路
本专利技术首先提供了一株大肠杆菌(Escherichiacoli)DHK-161114，于2016年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016645，保藏地址为中国武汉的武汉大学。该菌株形态呈短杆状，在固体培养基上菌落呈透明的圆形。本专利技术还提供利用所述大肠杆菌生物转化柚皮素生产香橙素的方法，包括以下步骤(1)制备种子培养液：将纯种接种到种子培养基中，在28～32℃条件下，180～200rpm摇床振荡培养13～17h，制得种子液；(2)细胞培养：将种子液，按体积比2～10％的接种量接入发酵培养基中，在35～37℃条件下，150～300rpm培养2～8h；(3)诱导：发酵液降温至30℃，加入诱导剂进行诱导，继续培养2～10h；(4)转化：加入2～6g/L浓度为40％的柚皮素溶液进行发酵转化，发酵周期为40～70h。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)将种子液，按体积比3～8％的接种量接入发酵培养基中，在37℃条件下，150～300rpm培养2～8h。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)将步骤(2)的细胞培养液降温至30℃，加入0.8～2.5％的乳糖或0.1～1.0mMIPTG进行诱导，继续培养2～10h。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)采用发酵罐发酵时，发酵罐培养条件为：温度控制37℃，pH不低于6.5～6.8，转速控制100～700rpm，溶氧偶联搅拌，溶氧控制30％以上，通气比0.6vvm；发酵液pH开始上升至7.3～8.0时，开始加入0.8～2.5％的乳糖或0.1～1.0mMIPTG诱导培养。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(4)采用发酵罐发酵时，维持温度30℃，pH控制7.3～8.6，转速100～700rpm，溶氧偶联搅拌，溶氧控制30％以上，通气比0.6vvm，以0.1～0.6g/L/h的速率加入2～6g/L浓度为40％的柚皮素溶液开始转化，同时以0.1～0.6g/L/h的速率补加葡萄糖。葡萄糖补加量为300g/L。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(4)采用发酵罐发酵时，将2～6g/L浓度为40％的柚皮素溶液分批次加入，每次加入0.1～1.0g/L，同时以0.1～0.6g/L/h的速率补加葡萄糖。葡萄糖补加量为300g/L。在本专利技术的一种实施方式中，种子培养基：蛋白胨1～10g/L，酵母抽提物1～10g/L，氯化钠0～10g/L，pH调节5.0～7.5，121℃高压蒸汽灭菌20min。在本专利技术的一种实施方式中，发酵培养基：蛋白胨1～10g/L，酵母抽提物1～10g/L，氯化钠0～10g/L，pH调节5.0～7.5，121℃高压蒸汽灭菌20min。在本专利技术的一种实施方式中，发酵培养基：蛋白胨2.5～7.5g/L，酵母抽提物1～7.5g/L，氯化钠0～10g/L，pH调节5.0～7.5，121℃高压蒸汽灭菌20min。在本专利技术的一种实施方式中，发酵培养基：蛋白胨2.5g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH调节7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(4)还可以将步骤(3)经诱导培养后的菌体离心收集，然后借助缓冲液构建全细胞转化体系，催化柚皮素合成香橙素。在本专利技术的一种实施方式中，发酵过程通过添加磷酸或盐酸、氢氧化钠或氨水来控制pH。本专利技术的优点：本专利技术以柚皮素为底物的微生物转化法生产香橙素，质量转化率达70～90％，生产成本低、生产工艺简单、安全清洁、无污染、环境友好等优点，充分保持了香橙素的天然性，首次实现了天然香橙素的生物合成。相比较于从植物中提取天然香橙素，本专利技术方法获得单位天然香橙素的生产成本大大降低，且生产方法简单，有利于实现工业生产。本专利技术所公布的方法所制得的发酵液中香橙素水平较高，发酵液中香橙素浓度达到3～5g/L，底物转化率也达到70～90％，且得到的香橙素发酵液成分简单，底物残留少，容易提取高纯度香橙素晶体。生物材料保藏一株大肠杆菌(Escherichiacoli)DHK-161114，于2016年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016645，保藏地址为中国武汉的武汉大学。附图说明图1大肠杆菌使用不同浓度蛋白胨培养基摇瓶发酵合成香橙素的情况图2大肠杆菌使用不同浓度酵母提取物培养基摇瓶发酵合成香橙素的情况图3大肠杆菌摇瓶发酵合成香橙素不同诱导时间的情况具体实施方式分析方法：采用高效液相色谱法分析发酵液中的底物柚皮素和产物香橙素。采用岛津SPD-M20A二极管阵列检测器，Phenomenexluna5uC18色谱柱(150mm×4.6mm，5μ)；流动相15％～70％乙腈：85％～30％0.15％(w/v)乙酸溶液梯度洗脱；流速0.8ml/min；柱温35℃；进样量5μL。实施例1出发菌株：该出发菌株为大肠杆菌(E.coli)DHK-161114CCTCCNO:M2016645。平板培养：将穿刺管保存的大肠杆菌划线接种至平板培养基上，在30℃培养箱中培养15～24h。制备大肠杆菌CCTCCNO:M2016645菌种库：挑取单菌落，接种到种子培养基中，在30℃条件下，200rpm摇床震荡培养13～17h，吸取所得种子培养液0.5ml转移至50％甘油溶液中，配制成终浓度25％的种子甘油管，-80℃保存。制备种子液：吸取20uL种子甘油管，接种到种子培养基中，在30℃条件下，200rpm摇床震荡培养13～17h，制得种子液。制备种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，自来水配制，pH调节7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。制备发酵培养基：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株大肠杆菌(Escherichia coli)DHK‑161114，于2016年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016645，保藏地址为中国武汉的武汉大学。

【技术特征摘要】
1.一株大肠杆菌(Escherichiacoli)DHK-161114，于2016年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016645，保藏地址为中国武汉的武汉大学。2.一种应用权利要求1所述大肠杆菌生物转化柚皮素生产香橙素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备种子培养液：将纯种接种到种子培养基中，在28～32℃条件下，180～200rpm摇床振荡培养13～17h，制得种子液；(2)细胞培养：将种子液，按体积比2～10％的接种量接入发酵培养基中，在35～37℃条件下，150～300rpm培养2～8h；(3)诱导：发酵液降温至30℃，加入诱导剂进行诱导，继续培养2～10h；(4)转化：加入2～6g/L浓度为40％的柚皮素溶液进行发酵转化，发酵周期为40～70h。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)将种子液，按体积比3～8％的接种量接入发酵培养基中，在37℃条件下，150～300rpm培养2～8h。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)将步骤(2)的细胞培养液降温至30℃，加入0.8～2.5％的乳糖或0.1～1.0mMIPTG进行诱导，继续培养2～10h。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)采用发酵罐发酵时，发酵罐培养条件为：温度控制37℃，pH不低于6.5～6.8，转速控制100～700rpm，溶氧偶联搅拌，溶氧控制30％以上，通气比0.6vvm；...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨皓茹，方林，周睿，余晓丹，
申请(专利权)人：无锡新和源发酵技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32