一种联产丙酮酸和α-酮戊二酸的重组光滑球拟酵母制造技术

本发明专利技术公开了一种联产丙酮酸和α‑酮戊二酸的重组光滑球拟酵母，属于发酵工程技术领域。通过基因工程技术，将来源于酿酒酵母的CDC19整合到pY26‑TEF‑GPD表达载体上，构建酵母重组表达质粒pY26‑CDC19，并将其电转进受体菌TgU‑中获得一株高产丙酮酸的工程菌株TgU

A co production of pyruvic acid and alpha ketoglutarate recombinant Candida glabrata

The invention discloses a production of pyruvic acid and alpha ketoglutarate recombinant Candida glabrata, which belongs to the technical field of fermentation engineering. Through gene engineering, CDC19 derived from Saccharomyces cerevisiae is integrated into the pY26 TEF GPD expression vector, to construct yeast recombinant expression plasmid pY26 CDC19, and will get a high-yield pyruvate into the electrical engineering in the TgU receptor bacteria strain TgU

【技术实现步骤摘要】
一种联产丙酮酸和α-酮戊二酸的重组光滑球拟酵母
本专利技术涉及一种联产丙酮酸和α-酮戊二酸的重组光滑球拟酵母，属于发酵工程

技术介绍
酮酸是分子中同时含有羧基和酮基的化合物。根据分子中羧基和酮基的相对位置可分为α、β-酮酸，它们是一类在生物体内拥有重要作用的有机酸，同时目前社会对其需求量也不断在增加，其广泛应用于日化，食品，医疗，农业等行业。其中α酮酸是羧基在α碳原子上的的酮酸，丙酮酸是最简单的α酮酸。丙酮酸作为生物代谢的中间产物，处于各代谢途径的中间环节，是糖酵解的终产物；通过脱氢脱羧反应转化为TCA循环的起始物质乙酰-CoA；在丙酮酸羧化酶作用下生成TCA循环的中间产物草酰乙酸；通过转氨基作用生成丙氨酸等。同样，α-酮戊二酸作为例外一种重要的酮酸，是细胞内氮代谢的主要调控者。α-酮戊二酸作为谷氨酸的前体，与脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸、多巴胺的分泌紧密相关，能有效维持胞内的“谷氨酸池”(glutaminepools)，并在中间代谢过程中决定着氮代谢流走向合成或者分解，有效的维持体内氮代谢平衡。α-酮戊二酸还与蛋白质、脂类、维生素合成以及能量代谢紧密相关。目前对其上述两种重要的酮酸的生产主要是化学合成法和微生物发酵法两大类。其中微生物发酵法相对于其化学合成有更多的优点，如原料的转化率高、污染小、成本低等优点。但其两种酮酸的微生物发酵采用的是独立的发酵操作。由于微生物合成目标产物时，不可避免的存在副产物的积累，而两种酮酸在生物体的转化是极其容易，因而其单独发酵生产其中的某一种酮酸时，不可避免的要消除例外一种酮酸的存在，但是消除副产物的努力通常会显著降低转化率和生产强度，从而影响整个发酵过程的经济性。如何将其两种酮酸在一种微生物中进行联产发酵，将对整个酮酸工业的发展有这重要的作用。联产发酵技术作为一种高效、经济的发酵技术成为了国内外研究的热门。通过微生物联产发酵获得高产丙酮酸和α-酮戊二酸，其最关键是要有一株高产丙酮酸和α-酮戊二酸的菌株。目前其两种酮酸的联产发酵鲜有文献报道。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术通过在高产丙酮酸的光滑球拟酵母菌株中过量表达丙酮酸激酶，加强丙酮酸和α-酮戊二酸合成的共同合成途径，从而对其两种酮酸进行高效率联产发酵。本专利技术的第一个目的是提供一种联产丙酮酸和α-酮戊二酸的重组菌，所述重组菌是以光滑球拟酵母为宿主，以pY26-TEF-GPD为载体，过表达丙酮酸激酶CDC19基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述CDC19基因是NCBI上GeneID为851193的CDC19基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌是以缺失了URA3基因的光滑球拟酵母T.glabrataCCTCCM202019为宿主，表达NCBI上GeneID:851193的CDC19。在本专利技术的一种实施方式中，所述CDC19基因是以酿酒酵母菌株S288c基因组为模板扩增得到的。本专利技术的第二个目的是提供所述重组菌的构建方法，是以缺失了URA3基因的光滑球拟酵母T.glabrataCCTCCM202019为宿主，以pY26-TEF-GPD为载体，表达NCBI上GeneID为851193的CDC19基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌按如下方法构建：(3)将目的片段CDC19经过限制性内切酶NotI和PacI双酶切消化后，并将CDC19定向克隆到表达质粒pY26-TEF-GPD中，得到重组酵母表达质粒pY26-CDC19；(4)重组质粒pY26-CDC19电转化受体菌T.glabrataCCTCCM202019(TgU-)，在不含尿嘧啶的培养基中进行筛选，得到重组菌TgU-(pY26-CDC19)。在本专利技术的一种实施方式中，所述酵母表达质粒pY26-TEF-GPD为大肠杆菌-酵母之间的穿梭载体，在大肠杆菌中选择标记为Ampr，而在酵母中选择标记为尿嘧啶缺陷型互补。本专利技术的第三个目的是提供一种联产丙酮酸和α-酮戊二酸的方法，是将所述重组菌应用于丙酮酸和α-酮戊二酸的生产。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是应用所述重组菌接种至发酵培养基，在30℃，200～220rpm条件下进行发酵培养。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌经过活化。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基每L中含有：葡萄糖50-120g，尿素0-5g，MgSO4.7H2O0-1g，KH2PO40-5g，CH3COONa0-5g，微量元素液10ml，维生素液10ml，初始pH＝5.5；所述微量元素液每L含有MnCl2·4H2O0-12g，FeSO4·7H2O0-2g，CaCl2·2H2O0-2g，CuSO4·5H2O0-0.1g，ZnCl20-1g；所述维生素液每L含有：生物素0-0.01g，硫胺素0-2mg，吡哆醇0-0.2g，烟酸0-2g。在本专利技术的一种实施方式中，所述微量元素液的配制方法为：将MnCl2·4H2O0-12g，FeSO4·7H2O0-2g，CaCl2·2H2O0-2g，CuSO4·5H2O0-0.1g，ZnCl20-1g用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。在本专利技术的一种实施方式中，所述维生素液的配制方法为：将生物素0-0.01g，硫胺素0-2mg，吡哆醇0-0.2g，烟酸0-2g用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。在本专利技术的一种实施方式中，所述接种的接种量按体积比为5-10％。本专利技术还要求保护所述方法在日化、食品、医药、农业领域生产含丙酮酸和/或α-酮戊二酸的产品中的应用。有益效果：本专利技术的方法可对其丙酮酸和α-酮戊二酸进行高效的联产发酵；由于要想同时获得其2种酮酸，其共同的合成途径通量必须足够大，本专利技术通过过量表达其2种酮酸共同合途径上的关键酶-丙酮酸激酶，加强其二者的合成效率和通量，来达到对其2种酮酸进行高效联产发酵的目的。总酸产量(丙酮酸和α-酮戊二酸)、总酸转化率和总酸生产强度分别提高了112.2％、115.6％和155.6％，最重要的是重组菌TgU-(pY26-CDC19)的α-酮戊二酸产量从其改造之前的0g/L增加到了30.1g/L。此外，相对于解脂亚洛酵母WSH-Z06(甘油84h耗尽，α-酮戊二酸和丙酮酸浓度达到32.8，30.4g/L，底物转化率为63％，生产强度为0.75g/L·h)，本专利技术的联产方法使丙酮酸和α-酮戊二酸生产周期缩短了24h，总酸量提高了31.6％，生产强度提高了84.0％。具体实施方式菌株和质粒：光滑球拟酵母(T.glabrataCCTCCM202019，TgU-)其为烟酸、生物素、硫胺素、盐酸吡哆醇，尿嘧啶5种营养缺陷型菌株(即在T.glabrataCCTCCM202019的基础上敲除了Ura基因)，已进行保藏。酵母表达质粒pY26-TEF-GPD为大肠杆菌-酵母之间的穿梭载体，在大肠杆菌中选择标记为ampr，而在酵母中选择标记为尿嘧啶缺陷型互补。细胞干重的测定：取一定量的菌悬液于10mL容量瓶中，加入2mL盐酸(2mol/L)溶解悬液中的碳酸钙，加去离子水定容到10mL，充分混匀，用UV7500型可见光分光光度计，于660nm处测定OD值，利用细胞干重标准曲线计算出细胞干重。丙酮酸、α-酮戊二酸和葡萄糖的测定：高效液相色谱(HPLC)。仪器：Agilent1260本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种联产丙酮酸和α‑酮戊二酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以光滑球拟酵母为宿主，以pY26‑TEF‑GPD为载体，过表达丙酮酸激酶CDC19基因。

【技术特征摘要】
1.一种联产丙酮酸和α-酮戊二酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以光滑球拟酵母为宿主，以pY26-TEF-GPD为载体，过表达丙酮酸激酶CDC19基因。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述CDC19基因是NCBI上GeneID为851193的CDC19基因。3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以缺失了URA3基因的光滑球拟酵母T.glabrataCCTCCM202019为宿主，表达NCBI上GeneID:851193的CDC19。4.权利要求3所述重组菌的构建方法，其特征在于，是以缺失了URA3基因的光滑球拟酵母T.glabrataCCTCCM202019为宿主，以pY26-TEF-GPD为载体，表达NCBI上GeneID为851193的CDC19基因。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组菌按如下方法构建：(1)将目的片段CDC19经过限制性内切酶NotI和PacI双酶切消化后，定向克隆到表达质粒pY26-TEF-GPD中，得到重组酵母表达质粒pY26-CDC19；(2)将重组质粒pY26-CDC19电转化至受体菌T.glabrataCCTCCM...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，罗正山，堵国成，刘松，方芳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32