一种以显色反应作辅助手段筛选产酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种以显色反应作辅助手段筛选产酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物的筛选方法，包括以下步骤：1）兼性固碳氮微生物无碳、氮厌氧培养基的配制；2）采样地点的选择；3）好氧驯化富集；4）厌氧驯化富集；5）筛选兼性固碳氮微生物。所述步骤1）中兼性固碳氮微生物无碳、氮厌氧培养基的配制方法为:在固碳菌培养基和固氮菌培养基的混合液中添加氧化剂硫代硫酸钠、显色剂饱和的重铬酸钾溶液，优化组合后得到兼性固碳氮菌无碳氮培养基。本发明专利技术筛选得到的兼性固CO

Screening method for facultative carbon fixing nitrogen microorganism with screening reaction as an auxiliary means for screening alcohol producing metabolite

The invention discloses an auxiliary means of screening of alcohol metabolite and solid carbon nitrogen microbial screening method by color reaction, which comprises the following steps: 1) and carbon nitrogen microbial preparation without carbon and nitrogen in anaerobic medium; 2) sampling locations were selected; 3) aerobic acclimation 4) enrichment; anaerobic acclimation enrichment; 5) screening and microbial carbon and nitrogen fixation. The step 1) in facultative carbon nitrogen without microbial carbon and nitrogen anaerobic medium preparation method is: in carbon fixation bacteria adding oxidant sodium thiosulfate, mixed liquid medium and medium nitrogen fixing bacteria in potassium dichromate solution saturated color agent, optimized combination of solid carbon and nitrogen obtained after facultative bacteria carbon and nitrogen free medium. The invention obtains facultative solid CO obtained by screening

【技术实现步骤摘要】
一种以显色反应作辅助手段筛选产酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物的筛选方法
本专利技术涉及微生物固定CO2、N2领域，特别涉及一种以显色反应作辅助手段筛选产酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物的筛选方法。
技术介绍
目前，公知的微生物固碳菌、微生物固氮菌分别只能固定CO2和N2，在学术上和传统理论上固定N2的固氮菌和固定CO2的固碳菌分别早已被研究和发现。现有大量研究表明大自然中尤其是土壤中存在很多具有固碳功能的微生物，从微生物进化理论而言，微生物对环境的适应性强、变异快、代谢途径和营养类型多样化，同时固定N2和CO2的微生物的存在不无可能，尤其是分布在豆科植物（不施氮肥为最佳选择）根部土壤中（当然也不排除别的生境可能也存在这类微生物如分布于偏酸性水果、蔬菜、蜜饯的表面和果园含糖环境土壤中的一些真菌酵母菌）很多固氮菌中极有可能存在某些能同时具有固碳功能的微生物。另外，分布在水体尤其是深海中的一些固碳菌也极有可能存在某些能同时具有固氮功能的微生物。
技术实现思路
本专利技术提供了一种以显色反应作辅助手段筛选产酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物的筛选方法，包括以下步骤：1）能检测酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物无碳、氮厌氧培养基的配制；2）采样地点的选择，在豆科植物根部土壤中寻找兼性固碳氮微生物，或在水体中的藻类微生物中间，或在偏酸性pH4.5-5水果、蔬菜、蜜饯的表面或在果园中含糖环境土壤中的一些真菌酵母菌中间寻找兼性固碳氮微生物；3）好氧驯化富集，采用排水换气法配气,将血清瓶装满水后，倒扣于水中，按混合气按比例N2∶CO2∶O2=8.5∶0.5∶1用针筒打入相应量的N2、CO2和O2,用封口膜封口；将无氮、碳源培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中,以便排气；后将样品稀释液加入到装有无氮、碳源培养基的血清瓶中；置摇床振荡培养温度28℃,转速120r/min,2～3d为一个富集周期,每个周期结束后重新充气,重复富集过程共2～3次得到目的菌液；4）厌氧驯化富集，然后将目的菌液转接到新的装有培养基的血清瓶中,在好氧(空气∶CO2=9∶1)及厌氧(N2∶CO2=9∶1)两种气相状况下再次培养5～6个周期；5）筛选兼性固碳氮微生物。优选地，所述步骤5）筛选兼性固碳氮微生物为梯度平板分离，采用10倍梯度稀释方法将目的菌液制成悬液，浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,运用涂布平板培养法,先将培养基倒入无菌平板中,待凝固后编号（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）,每一号码设置三个重复,分别吸取各梯度稀释液0.1ml于相应平板中,用涂布棒涂布(从低浓度向高浓度涂布)于能检测到酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物无碳、氮厌氧培养基,将涂布好的平板平放于桌上静置5-10min,待菌液渗透于培养基内后30℃倒置培养；48h后挑取周围有绿色的菌落划线培养,重复三次。优选地，所述步骤5）筛选兼性固碳氮微生物，某些能耐高CO2浓度的兼性固CO2、N2菌用带胶塞试管分离。优选地，所述步骤1）中能检测酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物无碳、氮厌氧培养基的配制方法为:1)固碳菌培养基的配制，固碳菌培养基包括以下组分，(NH4)2SO45.0g/L、KH2PO41.0g/L、K2HPO42.0g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、NaCl20g/L、CaCl20.01g/L、FeSO40.01g/L、微量元素混合液2mL/L；pH值为6.2。固氮菌培养基的配制，固氮菌培养基包括以下组分：蔗糖10g/L、K2HPO4·3H2O0.5g/L、NaCl0.2g/L、CaCO31g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L，pH值为4.5。2）在固碳菌培养基和固氮菌培养基的混合液中添加氧化剂硫代硫酸钠、显色剂饱和的重铬酸钾溶液（K2Cr2O7）3滴和3mo1/L的浓H2SO43滴；优化组合后得到兼性固碳氮菌无碳氮培养基，包括以下组分成分:KH2PO41.0g/L、K2HPO42.0g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、NaCl20g/L、CaCl20.01g/L、FeSO40.01g/L、Na2S2.0g/L、微量元素混合液2ml/L；pH值7.0；优选地，所述固碳菌培养基的微量元素混合液包括以下组分，Na2MoO4·2H2O1.68mg/L、H3BO30.4mg/L、ZnSO4·7H2O1.0mg/L、MnSO4·5H2O1.0mg/L、CuSO4·5H2O7.0mg/L、CoCl2·6H2O1.0mg/L、NiSO4·7H2O1.0mg/L。优选地，所述兼性固碳氮菌无碳氮培养基的微量元素混合液包括以下组分：Na2MoO4·2H2O1.68mg/L、H3BO30.4mg/L、ZnSO4·7H2O1.0mg/L、MnSO4·5H2O1.0mg/L、CuSO4·5H2O7.0mg/L、CoCl2·6H2O1.0mg/L、NiSO4·7H2O1.0mg/L。本专利技术从固碳菌培养基、固氮菌培养基中分别去除碳和氮，因兼性固碳氮菌无碳氮培养基无电子传递体故加电子传递体硫代硫酸钠同时做氧化剂：最后优化组合出能检测酒精代谢产物的兼性固碳氮菌无碳氮培养基。本专利技术对传统的微生物学的营养和代谢理论作重要补充，目前固碳的微生物都需外加氮源，而兼性固CO2、N2菌在固碳时不需外加碳源，从而降低固碳成本，同时能产酒精代谢产物。兼性固CO2、N2菌应用到生物固氮上同样能降低生物固氮成本，兼性固CO2、N2菌将废弃的CO2转化为有用的物质能源从而为解决环境和能源双重危机提供了一条有效途径，是一条具有巨大开发潜力和广阔应用前景的绿色资源可再生技术路线。附图说明下面结合附图和具体实施方式进一步说明：图1是本专利技术以显色反应作辅助手段筛选产酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物的筛选方法的能检测酒精代谢产物的兼性固CO2、N2菌无碳氮培养基的优化组合图。具体实施方式本专利技术通过优化配制无氮、碳源的厌氧培养基并在培养基中加入能检测到酒精代谢产物的重铬酸钾（K2Cr2O7)进行平板分离（如对某些能耐高CO2浓度的兼性固CO2、N2微生物则用带胶塞试管代替，以便控制CO2/N2比例），筛选出一些产酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物。本专利技术一种以显色反应作辅助手段筛选产酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物的筛选方法，包括以下步骤：1）能检测酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物无碳、氮厌氧培养基的配制，该培养基是在固碳菌培养基和固氮菌培养基基础上优化组合而来的，同时在培养基中添加氧化剂硫代硫酸钠和显色剂重铬酸钾（K2Cr2O7)。2）采样地点的选择，兼性固CO2、N2微生物是一类具有特殊功能的细菌，据现有很多研究表明大自然中尤其是土壤中很多微生物都有固碳功能，但不一定有固氮功能。固氮菌大多分布在豆科植物（不施氮肥为最佳选择）根部土壤中，这部分的固氮菌极有可能有些会同时具有固碳功能。还有一类是藻类生物，这类微生物主要在水体中（当然也不排除别的生境可能也存在这类微生物，如分布于偏酸性pH4.5-5水果、蔬菜、蜜饯的表面和果园含糖环境土壤中的一些真菌酵母菌）。3）好氧驯化富集，采用排水换气法配气,将血清瓶装满水后，倒扣于水中，按混合气比例(N2∶CO2∶O2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以显色反应作辅助手段筛选产酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1）能检测酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物无碳、氮厌氧培养基的配制；2）采样地点的选择，在豆科植物根部土壤中寻找兼性固碳氮微生物，或在水体中的藻类微生物中间，或在偏酸性pH4.5‑5水果、蔬菜、蜜饯的表面，或在果园中含糖环境土壤中的一些真菌酵母菌中间寻找兼性固碳氮微生物；3）好氧驯化富集，采用排水换气法配气,将血清瓶装满水后，倒扣于水中，按混合气按比例N

【技术特征摘要】
1.一种以显色反应作辅助手段筛选产酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1）能检测酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物无碳、氮厌氧培养基的配制；2）采样地点的选择，在豆科植物根部土壤中寻找兼性固碳氮微生物，或在水体中的藻类微生物中间，或在偏酸性pH4.5-5水果、蔬菜、蜜饯的表面，或在果园中含糖环境土壤中的一些真菌酵母菌中间寻找兼性固碳氮微生物；3）好氧驯化富集，采用排水换气法配气,将血清瓶装满水后，倒扣于水中，按混合气按比例N2∶CO2∶O2=8.5∶0.5∶1用针筒打入相应量的N2、CO2和O2,用封口膜封口；将无氮、碳源培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中,以便排气；后将样品稀释液加入到装有无氮、碳源培养基的血清瓶中；置摇床振荡培养温度28℃,转速120r/min,2～3d为一个富集周期,每个周期结束后重新充气,重复富集过程共2～3次得到目的菌液；4）厌氧驯化富集，然后将目的菌液转接到新的装有培养基的血清瓶中,在好氧(空气∶CO2=9∶1)及厌氧(N2∶CO2=9∶1)两种气相状况下再次培养5～6个周期；5）筛选兼性固碳氮微生物。2.根据权利要求1所述的以显色反应作辅助手段筛选产酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于，所述步骤5）筛选兼性固碳氮微生物为梯度平板分离，采用10倍梯度稀释方法将目的菌液制成悬液，浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,运用涂布平板培养法,先将培养基倒入无菌平板中,待凝固后编号（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）,每一号码设置三个重复,分别吸取各梯度稀释液0.1ml于相应平板中,用涂布棒从低浓度向高浓度涂布于能检测到酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物无碳、氮厌氧培养基,将涂布好的平板平放于桌上静置5-10min,待菌液渗透于培养基内后30℃倒置培养；48h后挑取周围有绿色的菌落划线培养,重复三次。3.根据权利要求1所述的以显色反应作辅助手段筛选产酒精代谢产物的兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于，所述步骤5）筛选兼性固碳氮微生物，某些能耐高CO2浓度的兼性固CO2、N2菌用带胶塞试管分离。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：周盛，
申请(专利权)人：广西科技大学，
类型：发明
国别省市：广西,45