一种用于修饰微泡的多肽以及靶向GBM的药物制剂制造技术

本发明专利技术涉及一种用于修饰微泡的多肽，其包括从N端到C端依次排列的亲脂性结构域、细胞杀伤结构域和肿瘤靶向结构域，所述肿瘤靶向结构域为低密度脂蛋白模拟肽，所述亲脂性结构域与细胞杀伤结构域之间以及所述细胞杀伤结构域与肿瘤靶向结构域之间，由柔性多肽连接。本发明专利技术还涉及使用上述多肽制备的靶向GBM的药物制剂，还涉及使用上述微泡载剂制备的靶向GBM的药物制剂。本发明专利技术的多肽、载剂和药物制剂理化特性优良、生物相容性好、制备工艺简单、治疗效果好、靶向性能好，可有效穿过血脑屏障，并且特异性地靶向GBM。

A polypeptide for modifying microbubbles and a pharmaceutical formulation directed toward GBM

The invention relates to a method for peptide modified microbubbles, comprising a lipophilic domain, from the N to the C terminal sequence of cell killing domain and tumor targeting domain, the tumor targeting domain for low density lipoprotein mimic peptide, the lipophilic domain and cell killing domain and between the cell domain and tumor targeting domains connected by a flexible polypeptide. The invention also relates to a pharmaceutical preparation for targeting GBM prepared with said polypeptide, and also relates to a pharmaceutical preparation for targeting GBM prepared with the above-mentioned microbubble carrier. The invention of the polypeptide, carrier and drug preparation excellent physicochemical properties and good biocompatibility, simple preparation process, good treatment effect, targeting performance is good, can pass through the blood-brain barrier, and specifically targeted to GBM.

【技术实现步骤摘要】
一种用于修饰微泡的多肽以及靶向GBM的药物制剂
本专利技术涉及抗肿瘤药物制剂领域，更特别地，涉及一种修饰微泡的多肽，使用所述多肽制备的靶向GBM的微泡载剂和药物制剂。
技术介绍
多形性胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforme，GBM)是成人常见的高度恶性的中枢神经系统肿瘤，具有病程短、进展快、预后差等特点，中位生存期仅10-12个月。目前，针对GBM的治疗存在很多困难，其原因是多方面的。首先，GBM呈浸润性生长，与正常脑组织无明显分界，导致手术难以彻底切除，术后复发率高；其次，由于血-脑屏障的存在，绝大部分化疗药物无法抵达病灶杀伤胶质瘤细胞；此外，GBM位于中枢神经系统，而传统化疗药物不具备组织选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时也会造成对中枢神经系统的损害，副作用巨大。为了克服血-脑屏障的问题，有人提出使用微泡(microvesicle，MV)来搭载抗肿瘤药物。微泡是机体细胞在静息和应激状态下分泌产生的直径在100～1000nm之间的膜性囊泡，是一种新发现的作用关键却长期被忽略的细胞间通讯方式。MV通过高效结合，将其内容物(miRNA、cirRNA、蛋白质或其他信号分子)横向传递给受体细胞从而调节受体细胞的表型和生物学功能。进一步研究显示，MV具有以下特点：1)可通过多种方式(孵育、电穿击)包载各类药物(化疗药物、siRNA、miRNA)以避免其到达病灶前降解；2)在血液中稳定性好，MV装载的药物在体内可保持一个较长的循环半衰期从而提高疗效；3)生物相容性良好，无毒副作用；4)作为一种内源性的生物成分，MV广泛分布于生物体液和培养细胞上清中，来源广泛，极易获取；5)尤为重要的是，MV可穿过生物屏障，如血-脑屏障。因此，脂质双层结构的微泡作为一种内源性的细胞间物质传递介质，具备天然药物载体的巨大潜力。然而，微泡不能特异性地靶向肿瘤组织，仍然避免不了对正常组织的伤害。为拓展开发具有肿瘤靶向性的微泡药物，有学者通过基因转染母体细胞，使其分泌带有特定肿瘤靶向的MV载药系统，但该方法面临转染效率低，靶向MV获得不可控，耗时费力等弊端，仅停留在研究层面，如何实现高效、简便、易操作和可控性好的MV靶向修饰成为该领域亟待解决的难题。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种用于修饰微泡的多肽，其包括从N端到C端依次排列的亲脂性结构域、细胞杀伤结构域和肿瘤靶向结构域，所述肿瘤靶向结构域为低密度脂蛋白模拟肽，所述亲脂性结构域与细胞杀伤结构域之间以及所述细胞杀伤结构域与肿瘤靶向结构域之间，由柔性连接肽连接。优选地，所述低密度脂蛋白模拟肽的序列如SEQIDNO:1所示。优选地，所述亲脂性结构域的序列如SEQIDNO:2所示，并且该序列的N端天冬氨酸残基被乙酰化。优选地，所述细胞杀伤结构域的序列如SEQIDNO:3所示,并且该序列中的所有氨基酸残基均为D型。优选地，其特征在于，所述柔性连接肽由两个相连的甘氨酸残基组成。本专利技术还提供了一种靶向GBM的微泡载剂，其由上述多肽修饰微泡得到。本专利技术还提供了一种靶向GBM的药物制剂，其由上述微泡载剂搭载抗GBM药物得到。优选地，所述抗GBM药物为甲氨蝶呤。本专利技术还提供了一种制备上述靶向GBM的药物制剂的方法，其包括以下步骤：S1：使用抗肿瘤药物孵育细胞，使细胞分泌包载有所述抗GBM药物的微泡，收集所述包载有抗GBM药物的微泡；S2：将所述包载有抗GBM药物的微泡与所述用于修饰微泡的多肽混合孵育，所得产物经离心后得到所述药物制剂。优选地，产生微泡的细胞有很多中，常用的有树突状细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞。本专利技术具有以下优点：1)理化特性优良：纳米粒度仪测得LDL-KLA修饰的微泡制剂中位粒径为270nm，表面Zeta电位为-10mV。电镜结果显示，纳米颗粒的粒径均一、分散性好，无聚集现象。2)生物相容性好：制备该材料所使用的原料为细胞分泌的微泡、多肽，这些原材料均为生物材料，具有良好的生物相容性。3)制备工艺简单，本专利技术的微泡制剂与现有通过真核表达质粒转染母体细胞使其分泌靶向性微泡的方法不同，是通过物理化学的方法用肽段中的亲脂性结构域将细胞杀伤结构域和靶向结构域直接锚定于微泡表面，从而赋予微泡细胞杀伤和肿瘤靶向的功能，因此能够更加简单灵活地设计和添加上述功能结构域，其制备工艺更加直接简单，且针对性强。4)治疗效果好：体内外研究结果显示LDL-KLA修饰的微泡制剂能有效杀伤2D、3D培养的胶质瘤细胞和原位胶质瘤荷瘤鼠，其携带的KLA和MTX具有协同效应。5)靶向性能好，正常组织的毒副作用低：含LDL模拟肽的修饰可以增加载药MV与胶质瘤细胞表面LDLR受体的相互作用，体外细胞、3D肿瘤球和在体动物实验研究结果显示，LDL-KLA修饰的微泡制剂靶向性好，易被U87胶质瘤细胞摄取，实体瘤深层亦可摄取。6)功能可扩展：多功能融合肽修饰的载药微泡除了直接应用于胶质母细胞瘤的治疗外，其核心装置还可装载其他类型的治疗药物用于神经系统疾病，如炎症、退行性变的治疗，此外LDL模拟肽亦可替换成其他类型的靶向性肽段，实现疾病的协同靶向和协同治疗的功效。附图说明图1为LDL-KLA修饰的MTX微泡制剂的结构示意图；图2为LDL-KLA修饰的MTX微泡制剂的透射电镜图；图3为LDL-KLA修饰的MTX微泡制剂的粒径分布图；图4为胶质瘤细胞U87摄取MTX微泡制剂、LDL修饰的MTX微泡制剂和LDL-KLA修饰的MTX微泡制剂的荧光显微镜照片；图5为流式细胞术检测胶质瘤细胞U87摄取MTX微泡制剂、LDL修饰的MTX微泡制剂和LDL-KLA修饰的MTX微泡制剂后凋亡分布图；图6为分别摄取了PKH26标记的MTX微泡制剂和LDL-KLA修饰的MTX微泡制剂的U87胶质瘤球体的荧光显微镜照片；图7为MTX微泡制剂、LDL修饰的MTX微泡制剂和LDL-KLA修饰的MTX微泡制剂(MTX浓度相同)处理后的胶质瘤球体积变化情况；图8为Dir标记的MTX微泡制剂和LDL-KLA修饰的MTX微泡制剂经尾静脉注射后颅内荧光强度及持续时间；图9为对照组、MTX微泡制剂、LDL修饰的MTX微泡制剂和LDL-KLA修饰的MTX微泡制剂处理原位移植胶质瘤小鼠的生存曲线。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.包载甲氨蝶呤(MTX)的MV的制备鼠成纤维细胞L929常规培养，取5×106对数生长期细胞置于培养皿中，经终浓度为50μg/ml的MTX处理1h，随后将开盖状态的培养皿置于300J/m2的紫外UBV照射1h；16h后收集细胞培养上清，利用差速法离心提取MV：经4000g离心20min除去细胞及细胞碎片；取上清，经14000g离心2min进一步除去细胞碎片；取上清，经14000g离心60min后的沉淀即为包载有MTX的MV，并用1×PBS重悬备用。2.LDL-KLA修饰的MTX微泡制剂的制备与表征合成靶向性多肽，其序列如SEQIDNO:4所示。将浓度为10μM的靶向性多肽与MV(质量比为1:1000)在常温下置于摇床上2-3h，再将其置于4℃孵育过夜；所得产物经14000g离心60min，弃去游离多肽，分散沉淀获得LDL-KLA修饰的MTX微泡制剂。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于修饰微泡的多肽，其特征在于，包括从N端到C端依次排列的亲脂性结构域、细胞杀伤结构域和肿瘤靶向结构域，所述肿瘤靶向结构域为低密度脂蛋白模拟肽，所述亲脂性结构域与细胞杀伤结构域之间以及所述细胞杀伤结构域与肿瘤靶向结构域之间，由柔性连接肽连接。

【技术特征摘要】
1.一种用于修饰微泡的多肽，其特征在于，包括从N端到C端依次排列的亲脂性结构域、细胞杀伤结构域和肿瘤靶向结构域，所述肿瘤靶向结构域为低密度脂蛋白模拟肽，所述亲脂性结构域与细胞杀伤结构域之间以及所述细胞杀伤结构域与肿瘤靶向结构域之间，由柔性连接肽连接。2.根据权利要求1所述的用于修饰微泡的多肽，其特征在于，所述低密度脂蛋白模拟肽的序列如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求1所述的用于修饰微泡的多肽，其特征在于，所述亲脂性结构域的序列如SEQIDNO:2所示，并且该序列的N端天冬氨酸残基被乙酰化。4.根据权利要求1所述的用于修饰微泡的多肽，其特征在于，所述细胞杀伤结构域的序列如SEQIDNO:3所示,并且该序列中的所有氨基酸残基均为D型。5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于修饰微泡的多肽，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：任精华，何文山，叶之兰，张涛，伍钢，杨坤禹，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42