具有pNPPC水解酶活性的多肽，其编码基因、制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及具有pNPPC水解酶活性的多肽，其编码基因、制备方法及应用。本发明专利技术分离的多肽选自：(1)SEQ ID NO:4、6、8或10所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO:21或其N端截短至多15个氨基酸残基和/或C端截短至多28个残基所获得的片段；(3)在(1)或(2)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：4、6、8、10或SEQ ID NO:21或其片段所具备的pNPPC水解活性的由(1)或(2)衍生的多肽；和(4)含上述(1)、(2)或(3)所述氨基酸序列的多肽。本发明专利技术多肽如MPPX具有较高底物专一性等性能，非常适合于该酶在酶联免疫分析中的应用。

Polypeptide having pNPPC hydrolase activity, its coding gene, preparation method and Application

The present invention relates to polypeptides having pNPPC hydrolase activity, their coding genes, methods of preparation and uses thereof. The present invention: separation of polypeptide from the amino acid sequence of SEQ (1) ID NO:4, 6, 8 or 10 shows; (2) SEQ ID NO:21 or N truncated at least 15 amino acid residues and / or C truncated at most 28 residues of the amplified fragment (3;) in (1) or (2) amino acid sequence of the through substitution, deletion or addition of one or several amino acids, while preserving the hydrolytic activity of pNPPC SEQ ID NO:4, 6, 8, 10 or SEQ ID NO:21 or its fragments have made (1) or (2) derived polypeptide; and (4) containing the above (1), (2) or (3) the amino acid sequence of the polypeptide. The polypeptide of the invention has the characteristics of high substrate specificity, such as MPPX, and is very suitable for the application of the enzyme in enzyme linked immunoassay.

【技术实现步骤摘要】
具有pNPPC水解酶活性的多肽，其编码基因、制备方法及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及具有pNPPC水解酶活性的多肽，其编码基因、制备方法及应用。
技术介绍
对硝基苯酚磷酸胆碱(p-nitrophenylphosphorylcholine，pNPPC)是一种人工合成的较稳定的化合物，其结构如下所示：该结构中含有对硝基苯酚(pNP)结构，对硝基苯酚是一种呈黄色，在405-410nm处具有强烈的吸收的物质。以对硝基苯酚为骨架开发了众多的人工合成化合物以检测多种水解酶的活性，如对硝基苯酚磷酸盐用来检测磷酸酶活性，对硝基苯酚棕榈酸酯用来检测脂肪酶或酯酶活性等。高纯度的pNPPC化合物通常是无色的，但是其水解产生pNPP则呈亮黄色。由于其具有磷酸胆碱结构，所以通常被作为底物用来检测磷脂酶C的活力(Kurioka,S.J.，Biochem.(Tokyo)，1968，63:678-680)。除了磷脂酶C或溶血磷脂酶C能够作用于pNPPC外，其它报道能够水解该化合物产生显色产物对硝基苯酚的酶则非常少。TAMURAH.于1995年发表的文献中提及了一种来源于蜡样芽孢杆菌的鞘磷脂酶(Sphingomyelinase，SMase)也可以作用于pNPPC(TamuraH.等，Biochem.J.1995，309:757–764)。鞘磷脂酶与PLC的作用方式类似，其水解鞘磷脂产生神经酰胺和磷酸胆碱，因此其也同PLC一样作用于pNPPC产生显色反应。但是该酶水解pNPPC的能力要远远低于其水解鞘磷脂的能力。Florin-ChristensenJ.等(Florin-ChristensenJ.等，BiochemMolBiolInt.1999,47(2):283-92)于1999年发表的一篇文献中提及了来源于四膜虫中的一种分子量大小为58KDa的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶(glycerophosphocholinephosphodiesterase)可以在酸性条件下水解pNPPC产生对硝基苯酚。KanferJ.N.等(KanferJ.N.等，NeurochemRes.1990,(10):987-92.)于1990年发表的一篇文献中提及一种老鼠脑膜上的磷酸二酯酶可以pNPPC作为底物。Keppetipola.N.等(Keppetipola.N.等，NucleicAcidsResearch,2007,35(22):7721–7732)于2007年发表的一篇文献中提及一种来源于热纤梭菌(ClostridiumThermocellum)多核苷酸激酶-磷酸酶(polynucleotidekinase-phosphatase，CthPnkp)可以水解pNPPC，但是其活力远远低于底物为对硝基苯酚磷酸对硝基苯酚即bis(pNPP)。TrülzschK.等(TrülzschK.,等，Microbiology2001,147：203–213)于2001年发表的文献中提及一种来源于结肠炎耶尔森杆菌(Yersiniaenterocolitica)的周质中的分子大小为68KDa的2’,3’-环磷酸二酯酶(2’,3’-cyclicphosphodiesterase)可以水解pNPPC和bis(pNPP)。该类酶存在于细胞周质中，需要通过渗透休克法或破坏完整细胞的方法才能释放出来，在胞外并不能检测出其活性。VollmerW.等(VollmerW.等，MolecularMicrobiology，2001，39(6)，1610-1622)于2001年报道了一种来源于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的磷壁酸磷酸胆碱酯酶可以水解pNPPC，该酶的分子大小为72KDa。NittaM.等(NittaM.等，Biol.Pharm.Bull.2002，25(7):833—836)于2002年报道了一种由链霉菌(Streptomyceshiroshimensis)中分离纯化的分子量大小约为14KDa的碱性磷酸酶同时具有水解pNPPC产生对硝基苯酚，此外该蛋白还具有蛋白酶抑制剂的功能。Chen等(ChenS.,等，J.Bio.Chem.2004,279:31854-31862.)于2004年报道了一种来源于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的磷酸二酯酶，该酶具有pNPPC水解活性。当前报道能够作用于pNPPC生成生色底物pNP的酶主要可以分为磷脂酶C类(包括溶血磷脂酶C)、磷酸二酯酶、鞘磷脂酶等几类。但是其中相关报道较多的还是以磷脂酶C为主。但是磷脂酶C的作用底物除了这种人工合成底物pNPPC外，还有天然底物磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、甘油磷酸胆碱等。通常PLC更适合作用于天然底物，譬如来源于魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)的PLC其以pNPPC为底物的Km值为39mM，而以卵磷脂为底物的Km值则仅为3.4mM，远远低于合成底物pNPPC(Kurioka,S.J.，Biochem.(Tokyo)，1968，63:678-680)。另外，对于磷脂酶C而言，pNPPC并非其天然底物，所以对pNPPC的水解活性并不高。譬如来源于蜡样芽孢杆菌的磷脂酰胆碱磷脂酶C(PC-PLC)，其野生酶的比活性有679单位/mg(DurbanM.等，Eur.J.LipidSci.Technol.，2003，105:633-637)。蜡样芽孢杆菌的PC-PLC在枯草芽孢杆菌中重组表达的最大比活力为13190单位/mg(DurbanM.A.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.2007，74:634-639)。综上所述，当前关于能够水解pNPPC产生pNP的酶主要以磷脂酶C为主，但是该类酶的最适合作用底物并非pNPPC这种人工合成底物，因而这些酶的水解pNPPC的活力并不高。酶联免疫吸附分析法(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay，简写ELISA)是Engvall和Perlman于1971年首次报道建立的方法，该方法具有灵敏度高(可达到纳克级甚至皮克级)、特异性强、操作简单、耗时短，而且能够实现大通量操作等，因而发展非常迅速，应用非常广泛(苏芳等，粮食与食品工业，2013，20(3):65-69)。在酶联免疫分析中采用何种酶进行标记对其分析方法的稳定性、灵敏性等至关重要。在通常的酶联免疫分析中的标记酶的选择需要考虑如下一些因素，首先其反应需要较高的转换数，其次该酶需要较高的稳定性，该酶需要易于大规模低成本的制备，该酶易于获得高纯度的产品，另外在应用时干扰物质或抑制剂等较少，最后最好在待检测样品中内生的酶活性影响较小(R.等，Biochemicaleducation，1990，18(3):136-140)。酶联免疫分析中经常使用的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、葡萄糖氧化酶(GOD)、大豆过氧化物酶以及脲酶等。在这些酶当中，HRP是当前市场上使用量最大的酶，其在商品化的试剂盒中有近80％的使用率，而AP也有近20％的使用率(KhatkhatayM.I.等，J.Immunoassay，1999，20(3):151-183)。HRP的本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的多肽，所述多肽选自：(1)SEQ ID NO:4、6、8或10所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO:21或其N端截短至多15个氨基酸残基和/或C端截短至多28个残基所获得的片段；(3)在(1)或(2)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：4、6、8、10或SEQ ID NO:21或其片段所具备的pNPPC水解活性的由(1)或(2)衍生的多肽；和(4)含上述(1)、(2)或(3)所述氨基酸序列的多肽。

【技术特征摘要】
1.分离的多肽，所述多肽选自：(1)SEQIDNO:4、6、8或10所示的氨基酸序列；(2)SEQIDNO:21或其N端截短至多15个氨基酸残基和/或C端截短至多28个残基所获得的片段；(3)在(1)或(2)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQIDNO：4、6、8、10或SEQIDNO:21或其片段所具备的pNPPC水解活性的由(1)或(2)衍生的多肽；和(4)含上述(1)、(2)或(3)所述氨基酸序列的多肽。2.如权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于，(2)所述的片段选自：SEQIDNO:2、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31和SEQIDNO:49；或(4)所述的多肽为融合蛋白，优选为(1)、(2)或(3)所述的氨基酸序列与磷脂酶或亲和素的融合蛋白；或(4)所述的多肽由(1)、(2)或(3)所述的氨基酸序列与促进所述氨基酸序列表达、分泌、鉴定和/或纯化的氨基酸序列组成。3.如权利要求1或2所述的分离的多肽，其特征在于，所述磷脂酶是磷脂酶C，优选为来自芽孢杆菌属细菌如蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)的磷脂酶C，优选地，所述磷脂酶C含SEQIDNO:55所示的氨基酸序列，或由所述序列组成；或(1)、(2)或(3)所述的氨基酸序列直接与所述磷脂酶连接，或经由接头序列，优选为多甘氨酸接头序列与磷脂酶连接；或所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:53所...

【专利技术属性】
技术研发人员：周美凤，徐正军，许骏，牛其文，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31