利用金枪鱼下脚料制备的具有肝损伤修复作用的活性肽制造技术

本发明专利技术公开了一种利用金枪鱼下脚料制备的具有肝损伤修复作用的活性肽，其氨基酸序列为：Met‑Thr‑His‑Asp‑Asp‑Val‑Asp‑Glu。本发明专利技术以水产加工副产物金枪鱼下脚料为原料，从中提取具有肝细胞修复作用的胶原蛋白肽，简单易行，生产成本低，可以显著提高水产加工副产品的价值，避免浪费的同时还保护了环境，还能为开发相关功能性食品提供前期基础。

An active peptide prepared from tuna waste to repair liver injury

The invention discloses a method for preparation of tuna scraps can repair liver damage in active peptide, its amino acid sequence is: Met Thr His Asp Asp Val Asp Glu. The present invention in aquatic products processing by-products tuna wastes as raw materials, the extraction of collagen peptide, repair of liver cells from simple, low production cost, can significantly improve the aquatic products processing by-product value, avoid the waste and protecting the environment, but also provide a basis for the development of functional food.

【技术实现步骤摘要】
利用金枪鱼下脚料制备的具有肝损伤修复作用的活性肽
本专利技术涉及一种活性肽，特别涉及一种利用金枪鱼下脚料制备的具有肝损伤修复作用的活性肽。
技术介绍
海洋面积约占地球表面的71％，生活在海洋中的生物高达20万种，海洋生物独特的生活环境和生存方式注定了海洋产物所具备的复杂性、多样性和特殊性，所以从海洋生物中提取和分离有效的生物活性物质具有重要的意义，从海洋植物、海洋动物和海洋微生物中提取有效的活性物质越来越受到专家和学者们的关注。目前，人们研究最多的有海洋生物毒素、抗肿瘤因子、抗氧化因子、心血管活性肽等。人类的生活深受海洋毒素的影响，其中有毒的生物至今仍威胁着人们海上生活和生产，已经发现的海洋生物毒素有河豚毒素、刺尾鱼毒素、海蜇毒素、石房蛤毒素等。海洋生物毒素可直接开发为天然药物或者进一步作为先导化合物用于创新药物的设计。随着我国金枪鱼渔业的迅速发展，金枪鱼加工已成为远洋渔业经济发展的重中之重。金枪鱼产品主要为罐头加工，所产生下脚料占总重量50％-70％。主要以内脏、碎肉、鱼头为主，下脚料中不仅含有优质蛋白，而且富含大量的生物活性物质。但是现有金枪鱼下脚料只是简单利用，较浪费。非酒精性脂肪肝病是一种与酒精无关的病理综合征，主要特征是肝细胞内脂肪堆积和脂肪变性，NAFLD可发展到非酒精性脂肪性肝炎，最终有可能恶化为肝硬化甚至肝癌。NAFLD在发达国家发病率较高，发病率高达20％-30％，中国发达地区成人的NAFLD患病率在15％左右，严重威胁了人们的生活，但在我国的落后地区发病率较低。近年来随着国人生活水平的提高、人口老龄化和肥胖症的流行、人们摄入的脂肪和油脂逐渐增多，NAFLD患者近几年在我国出现逐步增多的趋势，成为影响人们身体健康最常见的肝脏疾病。关于NAFLD的发病机制，最为人们接受的是由Day提出的“二次打击”学说，脂质在肝细胞内的聚集构成了第一次打击，第二次打击是指在此基础上发生的氧化应激和脂质过氧化。NAFLD的发生过程包括胰岛素和瘦素抵抗、肝脏内脂肪的过度堆积、肝脏组织和细胞内的炎症反应等。胰岛素的主要功能是通过上调葡萄糖转运蛋白的浓度来促进葡萄糖的吸收，以此降低血糖的浓度。当细胞进行新陈代谢时，机体摄入的葡萄糖会转化为肝糖原储存在肝脏内，胰岛素的另一个作用可以储存脂类并抑制脂质分解，细胞内胰岛素抵抗会使储存的甘油三酸脂水解使血浆内自由脂肪酸的含量上升，从而导致了肝脏细胞中脂肪的蓄积。NAFLD的危害主要包括以下几个方面：可促进动脉粥样硬化，所以患者常伴有高血脂症，其血液粘稠度会有所上升，低密度脂蛋白由于分子量小，所以容易造成血管壁沉积的动脉，导致动脉弹性降低，降低其灵活性，并最终导致血液循环障碍，危及生命；NAFLD还会诱发高血压和冠心病，极易导致心肌梗塞而导致死亡；NAFLD还会损伤机体消化，人体所摄入的蛋白质、糖类和脂质都必须经过肝脏的代谢，但NAFLD患者肝脏受损，势必会累及消化系统。NAFLD可以加重肝脏损害。肝脏中脂肪的堆积。使得肝细胞肿大、变性，将细胞核挤压致一侧，还能进一步加重线粒体的负担，从而影响其他营养素、维生素、激素的代谢。长期的肝细胞变性会加速肝细胞的损害，使其进一步发展为肝纤维化甚至肝癌，且NAFLD可诱发或加重糖尿病。目前对于NAFLD无有效的治疗方法，多采用药物治疗和手术治疗等非基础治疗方法，非基础治疗主要包括改善胰岛素抵抗的治疗、NAFLD相关基础疾病和代谢症候群的治疗、抗氧化及抗炎和护肝治疗、减肥手术治疗等。研究证明，双胍类和噻唑烷类药物能够显著改善集体的胰岛素抵抗作用，但其中存在的副作用也不容小觑。NAFLD相关的基础疾病和代谢症候的治疗主要包括减肥治疗、降脂治疗和血管紧张素转换酶抑制剂治疗。包括节食和有氧运动在内的减肥运动可以在一定程度上减少身体内的脂肪含量，从而缓解身体压力，达到缓解的效果。降脂治疗与减肥治疗原理相同，但是降脂药物的效果和安全性也有待研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用金枪鱼下脚料制备的具有肝损伤修复作用的活性肽，以水产加工副产物金枪鱼下脚料为原料，从中提取具有肝细胞修复作用的胶原蛋白肽，简单易行，生产成本低，可以显著提高水产加工副产品的价值，避免浪费的同时还保护了环境，还能为开发相关功能性食品提供前期基础。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用金枪鱼下脚料制备的具有肝损伤修复作用的活性肽，其氨基酸序列为：Met-Thr-His-Asp-Asp-Val-Asp-Glu(SEQIDNo.1)。作为优选，通过以下步骤制备而得：(1)金枪鱼下脚料预处理：将新鲜金枪鱼下脚料的鱼肉部分清洗干净，然后匀浆得肉浆；(2)酶解反应：将步骤(1)的肉浆与水按照1g:3mL的料液比混合，然后加入碱性蛋白酶酶解反应；(3)超滤：步骤(2)酶解反应结束后，灭酶，离心，收集上清液，上清液用超滤膜超滤，分别截取三种分子量的分子段产物，并进行冷冻干燥，将三种分子量的分子段产物分别以10mg/mL的药物浓度作用于模型组细胞，筛选出能够使细胞内TG含量降低最多的组分；(4)SephadexG-25层析分离：取步骤(3)中得到的能够使细胞内TG含量降低最多的组分100mg加蒸馏水配制成2mL溶液，离心取上清后过0.22μm滤膜，将滤液过SephadexG-25柱进行层析分离，以蒸馏水作为洗脱液，将凝胶柱进行平衡洗脱；调节恒流泵流速为1.1mL/min，每管收集3.5min，在280nm下检测其吸光度，收集各峰的洗脱液，旋转蒸发后冷冻干燥；各峰产物分别配制成10mg/mL的药物浓度作用于模型组细胞，筛选出使细胞内TG含量降低率最多的峰产物即为目标肽。作为优选，步骤(2)中的酶解条件为：碱性蛋白酶用量为每g肉浆加入1000U，酶解温度50℃，pH10，时间6h。作为优选，步骤(3)中三种分子量具体如下：分子量＜5kDa，分子量5kDa-8kDa，分子量＞8kDa。本专利技术的有益效果是：以水产加工副产物金枪鱼下脚料为原料，从中提取具有肝细胞修复作用的胶原蛋白肽，简单易行，生产成本低，可以显著提高水产加工副产品的价值，避免浪费的同时还保护了环境，还能为开发相关功能性食品提供前期基础。附图说明图1是本专利技术＜5kDa酶解液进行G-25葡聚糖凝胶层析结果图。具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。本专利技术中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。金枪鱼下脚料购自浙江舟山佳和加食品加工有限公司；正常人肝细胞：张氏肝细胞(ChangLiver细胞)购自中南大学湘雅医学院细胞中心，本实验室传代培养。模型组细胞：选择生长状态良好的ChangLiver细胞，用15μg/mL的软脂酸对Changliver细胞进行诱导，分别在诱导12h、24h、48h、72h后收集细胞并测定TG含量，TG检测方法按照试剂盒说明书进行。选择使Changliver细胞内TG含量明显增加且细胞生长良好的诱导时间，建立体外NAFLD细胞模型。实施例：1、方法1.1、金枪鱼下脚料预处理取新鲜的金枪鱼下脚料鱼肉部分放入蒸馏水中轻轻搅拌，洗去杂质后匀浆，存放于-20℃备用。1.2、金枪鱼下脚料酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用金枪鱼下脚料制备的具有肝损伤修复作用的活性肽，其特征在于，其氨基酸序列为：Met‑Thr‑His‑Asp‑Asp‑Val‑Asp‑Glu。

【技术特征摘要】
1.一种利用金枪鱼下脚料制备的具有肝损伤修复作用的活性肽，其特征在于，其氨基酸序列为：Met-Thr-His-Asp-Asp-Val-Asp-Glu。2.根据权利要求1所述的利用金枪鱼下脚料制备的具有肝损伤修复作用的活性肽，其特征在于，通过以下步骤制备而得：(1)金枪鱼下脚料预处理：将新鲜金枪鱼下脚料的鱼肉部分清洗干净，然后匀浆得肉浆；(2)酶解反应：将步骤(1)的肉浆与水按照1g:3mL的料液比混合，然后加入碱性蛋白酶酶解反应；(3)超滤：步骤(2)酶解反应结束后，灭酶，离心，收集上清液，上清液用超滤膜超滤，分别截取三种分子量的分子段产物，并进行冷冻干燥，将三种分子量的分子段产物分别以10mg/mL的药物浓度作用于模型组细胞，筛选出能够使细胞内TG含量降低最多的组分；(4)SephadexG-25层析分离：取步骤(3)中得到的能够使细胞内TG含量降低最多...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁国芳，艾杨洋，黄芳芳，杨最素，李小娟，许丹，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33