一种土壤蛋白质的提取方法技术

本发明专利技术提供一种土壤蛋白质的提取方法，包括：向土壤样品中加入土壤蛋白质提取缓冲液，震荡，静置；置于沸水中加热，于0℃冰水中冷却，震荡，离心；将上清液过滤，向已过滤的上清液中加入Tris饱和酚，震荡，离心，弃去上清液，收集下层苯酚溶液；向下层苯酚溶液中加入甲醇醋酸铵溶液，‑20℃放置6h‑8h；离心，将上清液移出，收集蛋白质沉淀，再将蛋白质沉淀用丙酮清洗，冻干，得到蛋白质干粉。经SDS‑PAGE电泳检测发现通过上述方法提取的土壤蛋白质的条带较另外两种具有代表性的土壤蛋白质提取方法获得的蛋白质的条带更清晰。

Method for extracting soil protein

The present invention provides a method of extracting soil protein includes: adding to the soil samples soil protein extraction buffer, shock, static; heating in boiling water at 0 DEG C, water cooling, shock, centrifugation; the supernatant was filtered, adding Tris saturated phenol, to the supernatant filtered in shock, centrifugation. The supernatant was discarded, collecting the lower phenol solution; adding methanol ammonium acetate solution lower phenol solution, 20 C 6H 8h placed; centrifugal, the supernatant removed from the collection of protein precipitation, then protein precipitation with acetone cleaning, freeze-dried powder, protein. The SDS PAGE analysis revealed that soil protein bands than the other two kinds of representative soil protein extraction methods by using the method of extracting the protein bands more clearly.

【技术实现步骤摘要】
一种土壤蛋白质的提取方法
本专利技术涉及一种土壤蛋白质的提取方法。
技术介绍
环境宏蛋白质组学是近年来兴起的一种研究技术，该技术可以将土壤中复杂的微生物群体有效的进行综合分析，以揭示土壤生态系统中的变化。土壤环境中宏蛋白质组学的研究问题的关键在于，土壤蛋白质的提取和分析，其中蛋白质的提取是研究土壤环境的重点。土壤蛋白质的提取是土壤蛋白质组学研究的前提，然而由于土壤蛋白质提取方法的缺乏，当前土壤蛋白质组学的研究还不能有效的开展。因此，本专利技术针对土壤宏蛋白质提取方面的关键技术进行优化，以期本专利技术能在土壤宏蛋白质组学研究中做出一定贡献。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种有效的土壤蛋白质的提取方法。本专利技术所提供的土壤蛋白质的提取方法，包括下述步骤：1)向土壤样品中加入土壤蛋白质提取缓冲液，震荡，静置；2)置于沸水中加热，于0℃冰水中冷却，震荡，离心；3)将上清液过滤，向已过滤的上清液中加入Tris饱和酚，震荡，离心，弃去上清液，收集下层苯酚溶液；4)向下层苯酚溶液中加入甲醇醋酸铵溶液，-20℃放置6h-8h；5)离心，将上清液移出，收集蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀用丙酮清洗，冻干，得到蛋白质干粉。上述方法步骤1)中，所述土壤蛋白质提取缓冲液为中性的蛋白质提取缓冲液，具体可为pH6.8的蛋白质提取缓冲液。所述pH6.8的蛋白质提取缓冲液的配制方法为：称取十二烷基硫酸钠(SDS)1.25g，三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.2114g，NaCl0.8766g，二硫苏糖醇(DTT)0.386g，加入70ml双蒸水溶解，使用浓盐酸调节pH至pH6.8，最后使用双蒸水定容至100ml，即可。所述土壤样品与土壤蛋白质提取缓冲液的配比为1.8g-2.2g：5ml。所述震荡的速度为3000rpm-3200rpm，时间为10-20min，具体可为15min。所述静置的时间为3-5min，具体可为3min。上述方法步骤2)中，所述加热的时间为5-15min，具体可为10min。所述冷却的时间为3-5min，具体可为3min。所述震荡的速度为3000rpm-3200rpm，时间为5-10min，具体可为5min。所述离心的条件为：4℃下4500-5500rpm离心5-10min，具体可为4℃下5000rpm离心5min。上述方法步骤3)中，所述过滤采用0.45μm的尼龙滤膜。所述Tris饱和酚的pH值为8.0。所述上清液与Tris饱和酚的配比为3-4ml：2ml。Tris饱和酚购自北京索莱宝科技公司。所述震荡的速度为3000rpm-3200rpm，时间为15-30min，具体可为20min。所述离心的条件为：4℃下10000-13000rpm离心15-20min，具体可为4℃12000rpm离心20min。上述方法步骤4)中，所述甲醇醋酸铵溶液的浓度为0.1M。所述甲醇醋酸铵溶液的配制方法为：称取0.7708g醋酸铵溶于80ml甲醇溶液中，并定容至100ml。所述甲醇醋酸铵溶液与苯酚溶液的体积比为5-6：1。上述方法步骤5)中，所述离心的条件为：4℃下13000-15000rpm离心15-20min，具体可为4℃15000rpm离心20min。所述丙酮为预冷的丙酮。所述清洗可进行多次，具体可为3次。所述冻干的温度为-80℃。经SDS-PAGE电泳检测发现通过上述方法提取的土壤蛋白质的条带较另外两种具有代表性的土壤蛋白质提取方法(Wangetal.,2011土壤蛋白质提取方法，具体方法参考论文：CharacterizationofMetaproteomicsinCropRhizosphericSoil.JournalofProteomeResearch，2011(10)：932-940；Choureyetal.,2010土壤蛋白质提取方法，具体方法参考论文：DirectCellularLysis/ProteinExtractionProtocolforSoilMetaproteomics.JournalofProteomeResearch，2010(9)：6615-6622.)获得的蛋白质的条带更清晰。其中，蛋白质分离检测方法为：称取1.5mg冻干的蛋白质粉末加入1mlSDT缓冲液溶解得到蛋白质溶液，取20μl蛋白质溶液于2ml离心管中，加入5μl5×上样缓冲液制备成蛋白质样品，涡旋混匀后沸水浴加热10min，待样品冷却，取20μl蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，凝胶规格为12×16×18cm，蛋白质样品在电泳槽中加入电泳缓冲液，浓缩胶为5％聚丙烯酰胺凝胶，80V，电泳30min，分离胶为12％的聚丙烯酰胺凝胶，120V，电泳90min，15mA恒定电流进行电泳，室温，待电泳结束后，卸下胶片，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色。本专利技术的优点在于：土壤中腐殖酸含量高，其中腐殖酸HA溶于碱溶液，富里酸FA既溶于碱，也溶于水和酸，胡敏素HM溶于稀碱，不溶于水和酸，由此可知蛋白质提取缓冲液的pH对提取蛋白质影响较大，所以中性pH蛋白提取缓冲液可以最大程度的减轻腐殖酸的影响，且在提取过程中，沸水浴加热可以帮助细胞有效的裂解并使蛋白酶失活，防止蛋白质降解。本专利技术通过中性蛋白质提取缓冲液和沸水浴加热结合的土壤蛋白质提取法可以最大程度的排除了腐殖酸干扰。所提取的黑土土壤蛋白质较另外两种具有代表性的土壤蛋白质提取方法来说，经SDS-PAGE检测后条带清晰。附图说明图1为Wangetal.,2011、Choureyetal.,2010和本专利技术方法所提取的土壤蛋白质提取方法的SDS-PAGE胶图。其中，条带1为采用Wangetal.,2010的方法提取的番茄根际土壤蛋白质；条带2采用Choureyetal.,2010的方法提取的番茄根际土壤蛋白质；条带3采用本专利技术方法提取的番茄根际土壤蛋白质。图2为本方法提取不同土壤蛋白质的SDS-PAGE胶图。其中，条带4为采用本专利技术方法提取的露地土壤的蛋白质；条带5为采用本专利技术方法提取的番茄根际土的蛋白质；条带6为采用本专利技术方法提取的小麦秸秆还田后的番茄根际土。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术进行说明，但本专利技术并不局限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的Tris饱和酚购自北京索莱宝科技公司。下述实施例中所使用的试剂的配制方法为：100ml的蛋白质提取缓冲液的配制方法：称取SDS1.25g，Tris1.2114g，NaCl0.8766g，二硫苏糖醇(DTT)0.386g，加入70ml双蒸水溶解，使用浓盐酸调节pH至pH6.8，最后使用双蒸水定容至100ml。100ml0.1M甲醇醋酸铵溶液的配制：称取0.7708g醋酸铵溶于80ml甲醇溶液中，并定容至100ml。10mlSDT缓冲液配制：SDS0.4g，Tris0.121g，DTT0.039g，溶解于5ml双蒸水中，使用浓盐酸调节pH至pH6.8，最后使用双蒸水定容至10ml.5ml5％的浓缩胶配制：双蒸水3.4ml，30％丙烯酰胺混合液0.83ml(29.2g丙烯酰胺溶于50ml双蒸水中，加入0.8g双丙烯酰胺，使用双蒸水定容至100ml，过滤，4℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种土壤蛋白质的提取方法，包括下述步骤：1)向土壤样品中加入土壤蛋白质提取缓冲液，震荡，静置；2)置于沸水中加热，于0℃冰水中冷却，震荡，离心；3)将上清液过滤，向已过滤的上清液中加入Tris饱和酚，震荡，离心，弃去上清液，收集下层苯酚溶液；4)向下层苯酚溶液中加入甲醇醋酸铵溶液，‑20℃放置6h‑8h；5)离心，将上清液移出，收集蛋白质沉淀，再将蛋白质沉淀用丙酮清洗，冻干，得到蛋白质干粉。

【技术特征摘要】
1.一种土壤蛋白质的提取方法，包括下述步骤：1)向土壤样品中加入土壤蛋白质提取缓冲液，震荡，静置；2)置于沸水中加热，于0℃冰水中冷却，震荡，离心；3)将上清液过滤，向已过滤的上清液中加入Tris饱和酚，震荡，离心，弃去上清液，收集下层苯酚溶液；4)向下层苯酚溶液中加入甲醇醋酸铵溶液，-20℃放置6h-8h；5)离心，将上清液移出，收集蛋白质沉淀，再将蛋白质沉淀用丙酮清洗，冻干，得到蛋白质干粉。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述土壤蛋白质提取缓冲液为中性的蛋白质提取缓冲液，具体可为pH6.8的蛋白质提取缓冲液；所述pH6.8的蛋白质提取缓冲液的配制方法为：称取十二烷基硫酸钠1.25g，三羟甲基氨基甲烷1.2114g，NaCl0.8766g，二硫苏糖醇0.386g，加入70ml双蒸水溶解，使用浓盐酸调节pH至pH6.8，最后使用双蒸水定容至100ml，即可。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述土壤样品与土壤蛋白质提取缓冲液的配比为1.8g-2.2g：5ml；所述震荡的速度为3000rpm-3200rpm，时间为10-20min...

【专利技术属性】
技术研发人员：李乃荟，吴凤芝，陈宇飞，周新刚，刘守伟，潘凯，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23