一种Nα‑芴甲氧羰基‑Nε‑7‑甲氧基香豆素‑4‑乙酰基‑赖/鸟氨酸的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种Nα‑芴甲氧羰基‑Nε‑7‑甲氧基香豆素‑4‑乙酰基‑赖/鸟氨酸的制备方法，主要解决目前方法中处理复杂、收率较低、环境不友好的问题。本发明专利技术的技术方案：一种Nα‑芴甲氧羰基‑Nε‑7‑甲氧基香豆素‑4‑乙酰基‑赖/鸟氨酸的制备方法包括以下步骤：Nα‑芴甲氧羰基‑赖/鸟氨酸叔丁酯与7‑甲氧基香豆素‑4‑乙酸在缩合剂催化下缩合生成Nα‑芴甲氧羰基‑Nε‑7‑甲氧基香豆素‑4乙酰基‑赖/鸟氨酸叔丁酯，Nα‑芴甲氧羰基‑Nε‑7‑甲氧基香豆素‑4乙酰基‑赖/鸟氨酸叔丁酯再用三氟乙酸脱除叔丁酯，即得到产物Nα‑芴甲氧羰基‑Nε‑7‑甲氧基香豆素‑4‑乙酰基‑赖/鸟氨酸。本发明专利技术产物主要作为荧光探针或者标记物。

A N alpha 9-fluorenylmethoxycarbonyl N e 7 methoxycoumarin 4 acetyl lysine ornithine / preparation method

The invention relates to a N alpha 9-fluorenylmethoxycarbonyl N e 7 methoxycoumarin preparation method 4 acetyl lysine / ornithine, the main treatment method at present to solve complex, low yield, environment friendly problem. The technical scheme of the invention: a N alpha 9-fluorenylmethoxycarbonyl N e 7 methoxycoumarin 4 acetyl lysine / ornithine preparation method comprises the following steps: N alpha 9-fluorenylmethoxycarbonyl Lai / ornithine tert butyl and 7 methoxycoumarin 4 in acetic acid catalyzed condensation condensation agent N alpha 9-fluorenylmethoxycarbonyl N e 7 methoxycoumarin 4 acetyl lysine ornithine / tert butyl N, alpha 9-fluorenylmethoxycarbonyl N e 7 methoxycoumarin 4 acetyl lysine ornithine / tert butyl ester with three fluorine acetic acid removal of tert butyl, to obtain the product of N alpha 9-fluorenylmethoxycarbonyl N e 7 methoxycoumarin 4 acetyl lysine / ornithine. The product of the invention is mainly used as a fluorescent probe or marker.

【技术实现步骤摘要】
一种Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-赖/鸟氨酸的制备方法
本专利技术涉及一种赖/鸟氨酸衍生物的制备方法，尤其是Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-赖/鸟氨酸的制备方法。
技术介绍
在免疫学和生物化学研究中，用荧光染料对蛋白质修饰是一个重要的手段，应用广泛。对于研究生物结构和功能、细胞内过程的显影、分子间相互作用，生物活化多肽的染料衍生物是个很有用的工具。荧光底物具有可连续检测、低浓度的高敏性等优点，因此提供了一种特别便利的酶活性检测方法。作为荧光探针或者标记物，香豆素系列化合物具有广阔而多样的应用前景，它们表现出更宽的光谱宽度，更好的光稳定性和高量子发射效率。7-甲氧基-4-乙酰基（Mca）就是一个典型，将Mca接入到赖氨酸上做成Fmoc-Lys(Mca)-OH，再通过固相合成的方法，嵌入到多肽链或者蛋白质上以后，从而引入荧光标记，大大方便观察蛋白质的系列生物化学反应。Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-赖氨酸[Fmoc-Lys(Mca)-OH]是一种应用前景广泛的多肽标记试剂。Cas号：386213-32-7。分子式：C33H32N2O8。分子量：584.62。目前的合成方法有两种，第一种，用于荧光基质固相合成中的Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-赖氨酸的合成（LettersinPeptideScience(2000)7:263.）公开了下述内容：赖氨酸盐酸盐与铜离子络合，得到赖氨酸铜盐络合物与7-甲氧基香豆素-4-乙酸在乙腈-DMF混合溶剂中缩合，然后通过树脂处理，得到Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-赖氨酸，Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-赖氨酸再用Fmoc-OSu上保护，即得到Fmoc-Lys(Mca)-OH，此方法步骤较长，总体收率为17%，收率较低，处理过程复杂，相对成本偏高。第二种，固相多肽中的荧光标记（Org.Biomol.Chem.,2008,6,4582-4586.）公开了下述内容：7-甲氧基香豆素-4-乙酸先与HOBt（1-羟基苯并三唑）在氯化亚砜催化下反应，生成4-(苯并三唑-1-乙酰基)-7-甲氧基香豆素，4-(苯并三唑-1-乙酰基)-7-甲氧基香豆素再与Nα-芴甲氧羰基-赖氨酸反应生成Fmoc-Lys(Mca)-OH，此反应过程中用到氯化亚砜，具有较强挥发性，气味难闻，不利于身体健康，两步反应处理都相对复杂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙酰基-赖/鸟氨酸的制备方法，主要解决现有合成方法中的收率低、处理复杂、环境不友好等问题。本专利技术的技术方案为：一种Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-赖/鸟氨酸的制备方法，包括以下步骤：Nα-芴甲氧羰基-赖/鸟氨酸叔丁酯（即Fmoc-Lys-OtBu或者Fmoc-Orn-OtBu，市面有售）与7-甲氧基香豆素-4-乙酸（市面有售）在缩合剂催化下缩合生成Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙酰基-赖/鸟氨酸叔丁酯，Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙酰基-赖/鸟氨酸叔丁酯再用三氟乙酸脱除叔丁酯，即得到产物Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-赖/鸟氨酸。具体操作步骤为，第一步，将Nα-芴甲氧羰基-赖/鸟氨酸叔丁酯和7-甲氧基香豆素-4-乙酸加入到DMF（N,N-二甲基甲酰胺）中，用冰盐浴降温到-10℃到0℃之间，滴加缩合剂的DMF溶液，保持温度在-5℃到5℃之间，滴加完毕，室温（20-30℃）搅拌过夜（12-16小时），过滤去盐，减压蒸馏去除DMF，残留物用乙酸乙酯溶解，有机相用饱和食盐水洗涤三次，用硫酸钠干燥，过滤去除硫酸钠，蒸干乙酸乙酯，得到中间体Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙酰基-赖/鸟氨酸叔丁酯。第二步，将Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙酰基-赖/鸟氨酸叔丁酯加入到适量二氯甲烷中，降温，保持温度在0℃到10℃之间，滴加三氟乙酸，然后室温（20-30℃）反应过夜，补加适量二氯甲烷，用饱和食盐水洗涤三次，用硫酸钠干燥，过滤去除硫酸钠，蒸去部分二氯甲烷，加入石油醚结晶，得到最终产物Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-赖/鸟氨酸。所述缩合剂为N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）、N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)中的一种。所述赖氨酸包括L-赖氨酸、DL-赖氨酸或D-赖氨酸中的一种，鸟氨酸为L-鸟氨酸、DL-鸟氨酸或D-鸟氨酸中的一种。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-赖/鸟氨酸的制备方法，避免了使用刺激性较大对身体有害的氯化亚砜，不产生蓝色铜盐废水。反应步骤短，处理方便，高效便捷，收率可高达54%。附图说明图1为本专利技术产品的红外图谱。图2为本专利技术产品的核磁共振图谱。具体实施方式实施例1：将等当量的Nα-芴甲氧羰基-L-赖氨酸叔丁酯和7-甲氧基香豆素-4-乙酸加入到DMF中，用冰盐浴降温到-10℃到0℃之间，滴加1当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)的DMF溶液，保持温度-5℃到5℃之间，滴加完毕，室温搅拌过夜（20-30℃），过滤去盐，减压蒸馏去除DMF，残留物用乙酸乙酯溶解，有机相用饱和食盐水洗涤三次，用硫酸钠干燥，过滤去除硫酸钠，蒸干乙酸乙酯，得到中间体Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙酰基-L-赖氨酸叔丁酯。另取一个烧杯，加入适量二氯甲烷，中间体Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙酰基-L-赖氨酸叔丁酯加入到烧杯中，降温，保持温度在0℃到10℃之间，滴加3倍当量的三氟乙酸，然后室温（20-30℃）反应过夜，补加适量二氯甲烷，用饱和食盐水洗涤三次，用硫酸钠干燥，过滤去除硫酸钠，蒸去部分二氯甲烷，加入石油醚结晶，得到最终产物Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-L-赖氨酸。纯度98.5%，两步收率51%。产品的红外和核磁共振图谱见图1、2。实施例2：将等当量的Nα-芴甲氧羰基-L-赖氨酸叔丁酯和7-甲氧基香豆素-4-乙酸加入到DMF中，用冰盐浴降温到-10℃到0℃之间，滴加1当量N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）的DMF溶液，保持温度-5℃到5℃之间，滴加完毕，室温搅拌过夜（20-30℃），过滤去盐，减压蒸馏去除DMF，残留物用乙酸乙酯溶解，有机相用饱和食盐水洗涤三次，用硫酸钠干燥，过滤去除硫酸钠，蒸干乙酸乙酯，得到中间体Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙酰基-L-赖氨酸叔丁酯。另取一个烧杯，加入适量二氯甲烷，中间体Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙酰基-L-赖氨酸叔丁酯加入到烧杯中，降温，保持温度在0℃到10℃之间，滴加3倍当量的三氟乙酸，然后室温（20-30℃）反应过夜，补加适量二氯甲烷，用饱和食盐水洗涤三次，用硫酸钠干燥，过滤去除硫酸钠，蒸去部分二氯甲烷，加入石油醚结晶，得到最终产物Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-L-赖氨酸。纯度98.1%，两步收率43%。产品的红外和核磁共振图谱见图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Nα‑芴甲氧羰基‑Nε‑7‑甲氧基香豆素‑4‑乙酰基‑赖/鸟氨酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤：Nα‑芴甲氧羰基‑赖/鸟氨酸叔丁酯与7‑甲氧基香豆素‑4‑乙酸在缩合剂催化下缩合生成Nα‑芴甲氧羰基‑Nε‑7‑甲氧基香豆素‑4乙酰基‑赖/鸟氨酸叔丁酯，Nα‑芴甲氧羰基‑Nε‑7‑甲氧基香豆素‑4乙酰基‑赖/鸟氨酸叔丁酯再用三氟乙酸脱除叔丁酯，即得到产物Nα‑芴甲氧羰基‑Nε‑7‑甲氧基香豆素‑4‑乙酰基‑赖/鸟氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-赖/鸟氨酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤：Nα-芴甲氧羰基-赖/鸟氨酸叔丁酯与7-甲氧基香豆素-4-乙酸在缩合剂催化下缩合生成Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙酰基-赖/鸟氨酸叔丁酯，Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4乙酰基-赖/鸟氨酸叔丁酯再用三氟乙酸脱除叔丁酯，即得到产物Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-赖/鸟氨酸。2.根据权利要求1所述的一种Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-赖/鸟氨酸的制备方法，其特征在于所述的缩合剂为N,N'-二异丙基碳二亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐中的一种。3.根据权利要求1所述的一种Nα-芴甲氧羰基-Nε-7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-赖/鸟氨酸的制备方法，其特征在于具体制备步骤如下：第一步，将Nα-芴甲氧羰基-赖/鸟氨酸叔丁酯和7-甲氧基香豆素-4-乙酸加入到N,N-二甲基甲酰胺中，用...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐红岩，周志国，蒋平，
申请(专利权)人：吉尔生化上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31