一类检测甲醛的荧光探针及其制备和应用制造技术

本发明专利技术提供一类检测甲醛的荧光探针，具有式I‑IV所示的结构，通过将苯环对应取代的香豆素先在甲苯中与劳森试剂回流反应，所得产物继续在乙醇中与水合肼回流反应制得。本发明专利技术提供的荧光探针本身在水溶液中无荧光，但可与甲醛发生特异性的快速反应，生成具有强荧光的产物，从而实现甲醛的特异灵敏性检测和定量分析。稳定性好，能够长期保存使用；检测信噪比高，灵敏度好；具有优秀的选择性，能在复杂生物样品中特异性地检测甲醛；具有良好的生物膜通透性，因而能用于活细胞中甲醛的检测；检测反应快速，对水溶液中的甲醛，1分钟内可给出检测结果；检测甲醛的同时不会影响环境中甲醛浓度。本发明专利技术探针的结构通式：

Fluorescent probe for detecting formaldehyde and preparation and application thereof

The present invention provides a kind of fluorescence probe to detect formaldehyde, I has the structure shown in the IV, the corresponding phenyl substituted coumarin first reaction with Lawson reagent reflux in toluene, the product continues to react with hydrazine hydrate in ethanol reflux system. The fluorescent probe provided by the invention itself in aqueous solution without fluorescence, but the specific rapid reaction with formaldehyde, reaction with strong fluorescence, so as to realize the detection and quantification of specific sensitivity analysis of formaldehyde. Good stability, can be preserved for a long time; the detection of high signal-to-noise ratio, good sensitivity; excellent selectivity in complex biological samples for specific detection of formaldehyde; with biological membrane permeability good, so they can be used in the detection of formaldehyde in living cells; detect the fast response, the formaldehyde in aqueous solution can be given. The detection results within 1 minutes; formaldehyde concentration detection of formaldehyde and does not affect the environment. The structural formula of the probe of the invention:

【技术实现步骤摘要】
一类检测甲醛的荧光探针及其制备和应用
本专利技术属环境分析化学及生物检测领域，涉及一类检测甲醛的荧光探针、其制备方法及在检测环境中及生物样本中甲醛含量中的应用。
技术介绍
甲醛是一种无色气体，有特殊的刺激气味，对人眼、鼻等有刺激作用。环境中高浓度的甲醛对人体有致敏、致畸和致癌等毒性，甲醛因而在2006年被确定为1类致癌物。因此，检测环境中，尤其是家具、新装修空间、新衣物材料、甚至食品中的甲醛含量是一项重要且有实际意义的工作。环境中高浓度甲醛的毒性作用在国内外已被深入研究。然而与之相反的是，近年来人们发现人体几乎所有细胞中均存在内源性甲醛！以大脑组织为例，研究发现，大脑组织中的生理内源性甲醛处于较高水平，其中皮层组织中甲醛浓度为0.2mmol/L左右，海马组织为0.4mmol/L左右，提示其可能参与到大脑正常的生理活动中；而大脑细胞中内源性甲醛的异常聚集可在醛酮应激、氧化应激等各种诱导因素的作用下，造成神经细胞功能障碍、变性死亡，导致学习、记忆功能障碍。目前，由于缺乏甲醛在生物原位环境中准确、简便定量分析的检测方法，甲醛的生理性和病理性作用研究受到极大限制。如何简便易行地检测和评估内源性甲醛的浓度水平和组织分布特征，对于预测和评估相关疾病的进展和程度，有着重要的临床意义。然而，常规的检测方法如分光光度法、色谱分析法等在医学和生命科学领域的应用存在诸多限制，如检测灵敏度较差，难以实现活细胞或活体组织中甲醛的实时在线检测等，这使得甲醛在活体生物样本中的生理及病理作用研究受到限制。因此，开发适用于复杂活体生物样本的灵敏度高、选择性好的甲醛快速分析检测方法对研究内源性甲醛的生理病理作用具有重要的意义。小分子荧光探针是检测细胞内分子事件的高效工具之一。小分子荧光探针检测法具有灵敏度高，选择性好等优点，兼之小分子探针通常具有良好的生物膜通透性，且可通过调整结构优化其在生物体内的吸收代谢性质，因此更适用于活细胞/活组织中微量代谢分子的检测。目前仅有少量用于甲醛检测的荧光探针被报导，而多数存在着检测反应慢、灵敏性差的问题，且在检测甲醛的同时会消耗部分甲醛，从而扰动生物样本中内源性甲醛的浓度。因此，发展高灵敏性、且不会扰动内源性甲醛浓度的新型荧光探针，是目前探针研究领域的前沿和热点。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一类检测甲醛的荧光探针，是一类新型的特异性小分子荧光探针，具有式I、II、III或IV所示的结构：其中：R1为氢，C1-C4烷基等；R2为氢，C1-C4烷基等；n为自然数1或2。本专利技术的又一个目的是提供式I、II、III及IV所示化合物的制备方法，通过以下制备方法实现：以式I所示化合物为例，7位N-R1，R2取代的香豆素与劳森试剂在干燥的甲苯中回流反应6小时，冷却后过滤，滤液旋干后所得的产物溶于乙醇，加入80％水合肼回流反应3小时，反应完毕，经萃取、浓缩、及柱层析纯化得式I所示化合物。式II、III及IV所示化合物采用类似的合成方法，以苯环对应取代的香豆素为起始原料制得。其中R1、R2和n的定义同上述。本专利技术的再一个目的是提供式I、II、III及IV所示化合物在制备检测环境中甲醛含量的检测剂中的应用。可通过以下步骤实现：(1)首先制备式I、II、III或IV所示化合物的水溶液；(2)上述溶液分若干份，分别置于密闭环境中，并在环境中充入已知不同量的甲醛，10小时后测其荧光强度；(3)以荧光强度对甲醛浓度作图，得工作曲线；(4)将第一步中制备的化合物溶液置于待检测环境中过夜，测其荧光强度；(5)利用第三步得到的工作曲线及第四步所测得的荧光强度，计算环境中的甲醛含量。本专利技术的又一个目的是提供式I、II、III及IV所示化合物在制备检测生物样本中甲醛含量的检测剂中的应用。本专利技术以活细胞中的应用为例，可通过以下步骤实现：细胞培养基中加入式I、II、III或IV所示化合物，使其终浓度为5μM，37℃下孵育30分钟，观察记录细胞荧光强度，本专利技术提供的荧光探针的特征在于它本身在生理环境中只有微弱的荧光，但可与甲醛特异性快速反应，生成具有强荧光的产物，且荧光强度与甲醛浓度间存在线性相关，从而实现对甲醛的特异性检测和定量分析。本专利技术涉及的荧光探针具有以下有益效果：(1)稳定性好，能够长期保存使用；(2)由于探针本身无荧光，只有在与甲醛反应后才有荧光，因此，检测信噪比高，灵敏度好；(3)具有优秀的选择性，能在复杂生物样品中特异性地检测甲醛；(4)具有良好的生物膜通透性，因而能用于活细胞中甲醛的检测；(5)检测反应快速，对水溶液中的甲醛，1分钟内可给出检测结果；(6)检测甲醛的同时不会影响环境中甲醛浓度。附图说明图1是荧光探针分子I-1与甲醛反应前后的荧光变化。图2是荧光探针分子I-1对甲醛的选择性。图3是荧光探针分子I-1对甲醛浓度依赖性荧光增强。图4是荧光探针分子I-1检测新橱柜中甲醛含量。图5是荧光探针分子I-1检测人大脑微血管内皮细胞中的内源性甲醛。图6是荧光探针分子I-1检测老年痴呆模型APP小鼠脑片活组织海马区域的内源性甲醛。图7是荧光探针分子I-1检测老年痴呆模型APP小鼠脑片活组织海马区域的内源性甲醛。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步说明，以下的实施例不限制本专利技术的范围。实施例1：荧光探针分子I-1的制备7-二乙基氨基香豆素(500毫克)和劳森试剂(1.86克)在干燥的甲苯中回流反应6小时。反应后，冷却过滤，滤液旋干溶剂后溶于乙醇，加入80％水合肼，回流反应3小时。反应完毕，旋干溶剂，加入水，以二氯甲醛萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化，得I-1(产率65％)。LC-MS：m/z232.3010[M+H]+。实施例2：荧光探针分子II-1的制备7-甲氧基香豆素(500毫克)和劳森试剂(1.86克)在干燥的甲苯中回流反应6小时。反应后，冷却过滤，滤液旋干溶剂后溶于乙醇，加入80％水合肼，回流反应3小时。反应完毕，旋干溶剂，加入水，以二氯甲醛萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化，得II-1(产率70％)。LC-MS：m/z191.2066[M+H]+。实施例3：荧光探针分子I-1与甲醛反应前后的荧光变化将探针分子以少量DMSO溶解，分别加入PBS缓冲液或甲醛的PBS溶液，使探针分子的终浓度为10μM,甲醛终浓度为500μM。反应10min后使用荧光分光光计以450nm激发，记录溶液在最大发射波长(约500nm)下的荧光强度，进而确定探针分子与甲醛反应后荧光强度增强，如图1所示。实施例4：荧光探针分子II-1与甲醛反应前后的荧光变化将探针分子以少量DMSO溶解，分别加入PBS缓冲液或甲醛的PBS溶液，使探针分子的终浓度为10μM,甲醛终浓度为500μM。反应10min后使用荧光分光光计以450nm激发，记录溶液在最大发射波长(约500nm)下的荧光强度，进而确定探针分子与甲醛反应后荧光强度增强，如图2所示。实施例5：荧光探针分子I-1对甲醛的选择性将探针分子以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液配置成溶液，分别加入PBS缓冲液溶解的各类可能干扰甲醛分析的待测样品，使探针分子的终浓度为10μM，各待测样品终浓度为300μM。反应30min后使用荧光分光光计以450nm激发，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类检测甲醛的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针具有式I、II、III或IV所示的结构：

【技术特征摘要】
1.一类检测甲醛的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针具有式I、II、III或IV所示的结构：其中：R1为氢或C1-C4烷基；R2为氢或C1-C4烷基；n为自然数1或2。2.权利要求1所述的一类检测甲醛的荧光探针的制备方法，其特征在于，通过以下制备方法实现：以式I所示化合物为例，7位N-R1，R2取代的香豆素与劳森试剂在干燥的甲苯中回流反应6小时，冷却后过滤，滤液旋干后所得的产物溶于乙醇，加入80％水合肼回流反应3小时，反应完毕，经萃取、浓缩、及柱层析纯化得式I所示化合物；式II、III及IV所示化合物采用以苯环对应取代的香豆素为起始原料制得。其中R1、R2和n的定义同权利要求1。3.根据权利要求1所述的一类检测甲醛的荧光探针在制备检测环境中甲醛含量的检测剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新，韩益丰，梁星光，卢应梅，韩峰，
申请(专利权)人：杭州汉晶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33