一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液制造技术

本发明专利技术涉及一种源于人胎脑皮层来源、用于治疗各种脑损伤的神经干细胞注射液，所述神经干细胞注射液中至少包含1×10

Neural stem cell injection for treating brain injury diseases

The present invention relates to a neural stem cell injection derived from the human fetal brain cortex and is used for treating various brain injuries, and the neural stem cell injection contains at least 1 * 10

【技术实现步骤摘要】
一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液
本专利技术涉及属于生物医药领域，具体涉及一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液和制备方法及其使用方法。
技术介绍
小儿脑瘫通常指出生前到出生后一个月内由各种原因引起的非进行性脑损伤或脑发育异常所导致的中枢性运动障碍。临床上以姿势与肌张力异常、肌无力、不自主运动和共济失调等为特征，常伴有感觉、认知、交流、行为等障碍和继发性骨骼肌肉异常，并可有癫痫发作，该病目前无理想的治疗手段，致残率高，给患者本人及家庭造成的精神负担和经济负担重。根据卫生部发布的数据计算，我国每年新生儿1600万人，据不同统计，小儿脑瘫发病率在千分之二到千分之五左右，即每年3-8万人；而由于以往人口出生率高、医疗条件落后导致发病率高、治愈率低等原因，有报道称我国已有累积小儿脑瘫患者500万人。因此该病危害十分严重。小儿脑瘫目前常用的治疗方式有物理治疗、作业治疗、家庭训练、矫形器等。常用的药物有脑神经营养药、肌肉松弛剂等，然而药物治疗只有在必要时才使用，它不能替代功能性训练。注射用鼠神经生长因子是被SFDA批准的一种生物制剂，提取自小鼠的颌下腺，与人的同源性达90％，采用肌肉注射的方式给药，据报道对小儿脑瘫引起的肌张力、运动发育、姿势异常、反射异常等症状有一定改善效果。目前所有的治疗小儿脑瘫的药物大多为提供营养，缓解症状，不能达到治疗的目的。也就是说，目前市场上并没有特异性治疗小儿脑瘫的有效药物。在临床上通常采取药物和运动康复相结合的办法。最近CFDA批准的一种注射用鼠神经生长因子生物制剂用于小儿脑瘫的治疗，该药物来源于小鼠的额下腺，与人的同源性达90％，采用肌肉注射方式给药，据报道对小儿脑瘫引起的肌张力，运动发育，姿势异常，反射异常等症状有一定改善效果。脑损伤主要还包括脑中风和创伤性脑损伤，国内外已有大量临床前实验研究表明神经干细胞(NSC)对于脑中风和创伤性脑损伤有一定的治疗效果。并且有部分临床试验证明NSC移植能够治疗脑损伤。神经干细胞(NSC)是一群较原始的、能自我更新并具有多种分化潜能的细胞,可分化成神经元、少突胶质细胞和星形细胞。在生理条件下,体内的NSC通常保持静息状态；神经损伤后,内源性NSC可因微环境的改变而被激活、迁移和分化,以替代损伤的细胞和重建神经环路；遗传修饰后,外源性NSC移植显示了很大的治疗潜力,为脑损伤的治疗提供了新的手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术存在的不足，一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液和制备方法及其使用方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术涉及一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，所述方法包括如下步骤：S1：原代细胞培养：将原代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增；其中，原代神经干细胞的来源为哺乳动物、灵长类动物或啮齿类动物的神经干细胞中的一种或几种；所述原代神经干细胞为手术分离废弃胎脑组织的皮层组织，然后消化酶将组织消化离心获得原代神经干细胞悬液；原代神经干细胞的来源方法包括IPSC诱导、提取胚胎干细胞、提取人类视网膜色素上皮细胞或提取神经组织器官以外的其他器官或组织干细胞。优选的，原代神经干细胞的来源为医疗废弃的人源胎脑皮层组织的神经干细胞。这种来源为完全100％人源，是一种单一的干细胞产品，用自主研发的无血清培养基和培养工艺，在体外培养到P3代，干细胞纯度可达95％以上，神经干细胞活性在90％以上。优选的，所述原代神经干细胞为手术分离废弃胎脑组织的皮层组织，细胞消化计数后，采用无血清完全培养基进行重悬，并调整密度为1x105个/ml，然后接种至超低吸附培养瓶中，放入35℃5％CO2中环境中进行培养。其中，无血清培养基是由DMEM/F12，B27，N2，以及神经营养因子BFGF,EGF,LIF组成，无任何动物源血清成分。S2：神经干细胞纯化及扩大培养：将扩增满的原代神经干细胞进行消化、传代，直至传到第5代,并鉴定细胞纯度达95％以上后，作为种子细胞；P5到P8代都可作为种子细胞，种子细胞可以冻存，便于保存。所述扩增满为至细胞直径超过300μm，然后进行消化传代至P1代神经干细胞；培养方法为连续培养10-14天，期间每24小时进行观察，确认细胞生长状态正常，每隔48-72小时进行换液；悬浮培养和贴壁培养的神经干细胞在显微镜下的形态见图1。P1代神经干细胞消化后接种至超低吸附培养瓶中，放入35℃5％CO2的环境中进行培养至传代，重复消化、接种、培养的过程直至传代到P5代神经干细胞；所述培养方法为每间隔48-72小时进行换液，连续培养10-14天。将P5代神经干细胞进行细胞特性和异源物质检测，细胞特性鉴定包括流式鉴定神经干细胞表面标记物SOX2和NESTIN,检测其纯度达95％以上，见图2。荧光免疫的方法鉴定神经干细胞特性和纯度为95％以上，并具有多种分化潜能，能够分化为神经元，星型胶质细胞和少突胶质细胞。异源物质主要是微生物的检测，包括无菌检测，支原体和内毒素检测，其结果阴性为合格，检测合格后将细胞冻存作为种子细胞。S3：神经干细胞工作细胞库的建立：将步骤S2中的种子细胞，计数并无血清培养基悬浮培养，待培养瓶细胞融合到80％—90％，将细胞消化传代，如此反复直至细胞传代P9代；S4：神经干细胞注射液的制备：将步骤S3中的P9代细胞加生理盐水定容或负载于微载体，制成临床用神经干细胞注射液。优选的，步骤S3的悬浮培养的方法包括以下步骤：具体方法参见申请号为201110173821.1的专利。(a)将神经干细胞接种在包含bFGF和EGF的DMEM/F12或DMEM培养基中培养；(b)2、3或4天后在培养基中添加5-20％体积的营养补充液并继续培养，其中所述营养补充液是包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mMol/L的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mMol/L的丙酮酸钠，0.5-1.5mMol/L的NAC，50-150ng/ml的bFGF，50-150ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF的DMEM/F12或DMEM培养基；(c)监测培养基中形成的神经球直径，当60％以上、优选70％以上神经球直径高于阈值时，分离直径高于所述阈值的神经球，消化后收获，其中所述阈值为200-500μm，例如为250μm、300μm、350μm、400μm或450μm；(d)未挑中的直径小于所述阈值的剩余细胞保留在原培养基中，将培养基移除1/2-1/4体积，然后添加与移除体积相同体积的(a)中所述的包含bFGF和EGF的培养基继续培养；(e)在(a)接种神经干细胞10、11、12、13、14或15天后通过合并(c)中收获的细胞和(d)继续培养所得的细胞而收获细胞。优选的，步骤S4中，所述微载体包括脂质体、微胶囊或微球载体。上述的制备方法制成的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液。上述的神经干细胞注射液中包含大于1×106个神经干细胞。上述的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的使用方法，将所述治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液植入患者体内；所述植入方法包括定点注射，静脉回输、鞘内注射、鼻腔粘膜吸附或肌肉注射。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术的神经干细胞注射液可来源自认废本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1：原代细胞培养：将原代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增；S2：神经干细胞纯化及扩大培养：将扩增融合到80％‑90％的原代神经干细胞进行消化、传代，直至传到第5代,并鉴定细胞纯度达95％以上后，作为种子细胞；S3：神经干细胞工作细胞库的建立：将步骤S2中的种子细胞，计数并无血清培养基悬浮培养，待培养瓶细胞融合到80％—90％，将细胞消化传代，如此反复直至细胞传代P6‑P9代；S4：神经干细胞注射液的制备：将步骤S3中的P6‑P9代细胞加生理盐水定容或负载于微载体，制成临床用神经干细胞注射液。

【技术特征摘要】
1.一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1：原代细胞培养：将原代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增；S2：神经干细胞纯化及扩大培养：将扩增融合到80％-90％的原代神经干细胞进行消化、传代，直至传到第5代,并鉴定细胞纯度达95％以上后，作为种子细胞；S3：神经干细胞工作细胞库的建立：将步骤S2中的种子细胞，计数并无血清培养基悬浮培养，待培养瓶细胞融合到80％—90％，将细胞消化传代，如此反复直至细胞传代P6-P9代；S4：神经干细胞注射液的制备：将步骤S3中的P6-P9代细胞加生理盐水定容或负载于微载体，制成临床用神经干细胞注射液。2.如权利要求1所述的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其特征在于，步骤S1和S3中无血清培养基是由DMEM/F12，B27，N2，以及神经营养因子BFGF,EGF,LIF组成，无任何动物源血清成分。3.如权利要求1所述的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其特征在于，步骤S1的原代神经干细胞的来源为哺乳动物、灵长类动物或啮齿类动物的神经干细胞中的一种或几种；所述原代神经干细胞为手术分离废弃胎脑组织的皮层组织，然后消化酶将组织消化离心获得原代神经干细胞悬液。4.如权利要求1所述的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其特征在于，步骤S1的原代神经干细胞的来源方法包括IPSC诱导、提取胚胎干细胞、提取人类视网膜色素上皮细胞或提取神经组织器官以外的其他器官或组织干细胞。5.如权利要求1所述的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其特征在于，步骤S1的原代神经干细胞的来源为医疗废弃的人源胎脑皮层组织的神经干细胞。6.如权利要求1所述的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其特征在于，步骤S3的悬浮培...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑佳威，赵雄飞，黄倩莹，
申请(专利权)人：上海安集协康生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31