共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子及制备方法，制备方法为：(1)聚赖氨酸接枝β‑环糊精衍生物的制备；(2)载化疗药物的纳米粒子的制备；(3)共载化疗药物和核酸的纳米粒子的制备；(4)共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子的制备；本发明专利技术制备工艺简单，易于操作，省时节能，且所用载体材料生物安全性高，具有良好生物相容性、可生物降解性、无毒性，无免疫原性。本发明专利技术的共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子具有典型的核‑壳结构，粒径为150～200nm，可以有效地将化疗药物和核酸同时携带进入高表达CD44分子的细胞，抑制细胞增殖，并具有显著的体内外肿瘤靶向性。

Tumor targeting nanoparticles containing chemotherapeutic drugs and nucleic acids in common and preparation method

The invention discloses a tumor carrying drugs and nucleic acids to nanoparticles and preparation method, the preparation method is as follows: (1) poly lysine grafted beta cyclodextrin derivatives preparation; (2) nanoparticles drug preparation; (3) carrying drugs and nuclear acid nanoparticles preparation; (4) tumor carrying drugs and nucleic acids to the preparation of nanoparticles; the preparation process is simple, easy to operate, time-saving and energy-saving, and the biological safety of carrier materials is high, with good biocompatibility, biodegradable, non-toxic, no immunogenicity. Carrying drugs and nucleic acids of the invention to tumor targeting nanoparticles with nuclear shell structure typical of the particle size of 150 ~ 200nm, can effectively be carried into the chemotherapy drugs and nucleic acid while high expression of CD44 molecules in cells, inhibit cell proliferation and in vivo tumor, with evident targeting.

【技术实现步骤摘要】
共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子及制备方法
本专利技术属于纳米药物领域，具体地涉及一种共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子及制备方法。
技术介绍
恶性肿瘤的发病率、死亡率呈现逐年增加的趋势，严重威胁着人类的健康。近年来，随着肝外科技术、麻醉技术以及围手术期处理水平的不断进步，手术治疗成为治疗恶性肿瘤的首选。然而，临床绝大多数的患者在确诊时已经失去了手术的机会。化疗也是治疗恶性肿瘤的常见策略之一，但是由于肿瘤具有异质性，单一的化疗往往不能取得理想的疗效，且患者易对化疗产生耐受。上个世纪60年代末，美国科学家MichaelBlaese首次在医学界提出了基因治疗的概念。肿瘤的发生发展过程中涉及多种基因的表达和功能异常，而这些基因异常与细胞的生长、分化和死亡等密切相关。基因/药物联合治疗能够针对肿瘤细胞内的不同靶点发挥治疗作用，从而发挥协同治疗作用，提高药物疗效；与单一治疗方法相比，联合治疗方法可以减少药物剂量，从而降低毒副作用；此外，基因/药物联合治疗还能够有效地降低肿瘤耐药的发生。然而，在实际应用中，联合治疗仍然面临着巨大的挑战，主要包括：如何保证核酸药物在体内不降解，如何解决化疗药物的溶解性问题，以及如何将二者同时靶向输送至肿瘤部位并实现有效释放。因此，设计一种简单有效的共输送体系是联合治疗成功的关键。聚赖氨酸是一种阳离子多肽，其结构中的伯氨基通过质子化作用而使其带正电荷，通过静电作用可与表面带磷酸基的核酸复合形成纳米粒子。低分子量的赖氨酸(＜3000)可质子化伯氨基数量少，较难与核酸形成稳定的复合物，而高分子的聚赖氨酸虽然可以提高转染效率，但却有着细胞毒性大的缺点。因此，有必要对其进行结构改造、表面修饰等方法来提高其性能。天然材料β-环糊精(β-Cyclodextrin,β-CD)，具有良好的生物相容性及可降解性等优势，其可以通过“主-客体”相互作用包合多种疏水性小分子，提高药物溶解性，增加药物稳定性。然而，单一的β-CD并不能与疏水性药物实现自组装。将β-环糊精引入聚合物的结构中使其具备特殊的结构与性质，是一种优良的药物载体材料。因此，将β-环糊精与聚赖氨酸有效的结合，不仅有效降低了聚赖氨酸的毒性，可以实现药物和核酸的共载。目前，尚未有用透明质酸与共载化疗药物和核酸制成肿瘤靶向纳米粒子的报道。
技术实现思路
本专利技术目的是克服现有技术的不足，提供一种制备简捷、省时节能的共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子。本专利技术的第二个目的是提供共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子的用途。本专利技术的技术方案概述如下：一种共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：(1)将6-醛基化β-环糊精、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐溶于pH＝4.4的醋酸盐缓冲溶液中，室温搅拌1-2h，加入氰基硼氢化钠，室温继续搅拌48～72h；加氢氧化钠水溶液使体系呈中性，在半透膜截留分子量为7000Da的条件下超纯水透析2d、透析液冷冻干燥获得聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物；所述聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物简称PLCD；所述聚-L-赖氨酸氢溴酸盐粘均分子量为15000～30000Da；以赖氨酸结构单元计的聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、6-醛基化β-环糊精和氰基硼氢化钠的摩尔比为1:(0.5～2):4；(2)按质量比为1:(0.3～0.5)的比例，将PLCD与疏水性化疗药物溶解于二甲基亚砜中，室温搅拌8～12h，在半透膜截留分子量为8000～14000Da的条件下纯水透析24h、冷冻干燥，得到载化疗药物的纳米粒子；(3)将载化疗药物的纳米粒子与核酸分别溶于DEPC水中，调节两种溶液的浓度使载化疗药物的纳米粒子与核酸的N/P摩尔比为30～50:1，将二者等体积混合，涡旋震荡20～30s，经室温静置孵育30～60min，得共载化疗药物和核酸的纳米粒子；(4)将共载化疗药物和核酸的纳米粒子滴加于质量浓度为0.75～1.0mg/mL的透明质酸水溶液中，在200-400rpm的条件下，搅拌5-10min，得共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子；透明质酸与共载化疗药物和核酸的纳米粒子的质量比为(3～4):6。疏水性化疗药物优选阿霉素、喜树碱或紫杉醇，也可以用其它的疏水性化疗药物。核酸优选为质粒DNA、小干扰RNA、microRNA或无功能核苷酸序列，也可以使用其它的核酸。质粒DNA优选质粒pEGFP-C1，也可以选其它的质粒。小干扰RNA为c-mycsiRNA，所述c-mycsiRNA核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。microRNA为miR-122，所述miR-122核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。无功能核苷酸序列为ControlRNA或异硫氰酸荧光素标记的RNA，即FAM-RNA；所述ControlRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述FAM-RNA的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。透明质酸分子量为20000～40000Da。上述方法制备的共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子。上述共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子在制备抗肝癌或抗乳腺癌药物中的应用。本专利技术的优点：本专利技术制备工艺简单，易于操作，省时节能，且所用载体材料生物安全性高，具有良好生物相容性、可生物降解性、无毒性，无免疫原性。本专利技术的共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子具有典型的核-壳结构，粒径为150～200nm，可以有效地将化疗药物和核酸同时携带进入高表达CD44分子的细胞，抑制细胞增殖，并具有显著的体内外肿瘤靶向性。附图说明图1，实施例1中β-环糊精(β-CD)、6-单-(对-甲苯磺酰基)-β-环糊精(6-Ts-CD)、6-醛基化β-环糊精(6-Ald-CD)、聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物(PLCD)的红外光谱图；图2，实施例1中的β-CD、6-Ts-CD、6-Ald-CD、PLCD的核磁氢谱图；图3，实施例1中不同氮磷比时载药体系PLCD/DOX压缩寡聚RNA的琼脂糖电泳结果；图4，实施例1中氮磷比为30:1时共载药物和基因的纳米复合物(PDR)的电子显微镜照片(a)和粒径分布图(b)；图5，实施例1中不同质量比时透明质酸(HA)包裹PDR纳米复合物后的琼脂糖电泳结果；图6，实施例1中不同质量比时HA包裹PDR纳米复合物后的粒径和Zeta电位分析；图7，实施例1中HA与PDR质量比为3:6时的共载药物和基因的肿瘤靶向纳米复合物(HPDR)的透射电子显微镜照片(a)及粒径分布图(b)；图8，实施例2中PDR及HPDR在不同pH值介质中阿霉素的体外释放曲线。图9，实施例3中PDR及HPDR分别处理肝癌细胞MHCC-97H后的激光共聚焦显微镜照片。图10，实施例4中PDR及HPDR分别处理肝癌细胞MHCC-97H的细胞毒性比较。图11，实施例5中PDR及HPDR在裸鼠体内的组织分布图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，本专利技术的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本专利技术，但并不对本专利技术作任何限制。质粒pEGFP-C1(市售)。6-单-(对-甲苯磺酰基)-β-环糊精(6-Ts-CD)的合成将180gβ-环糊精(β-CD)混悬于1.5L蒸馏水中，使用恒压滴液漏斗向混悬本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子的制备方法，其特征是包括如下步骤：(1)将6‑醛基化β‑环糊精、聚‑L‑赖氨酸氢溴酸盐溶于pH＝4.4的醋酸盐缓冲溶液中，室温搅拌1‑2h，加入氰基硼氢化钠，室温继续搅拌48～72h；加氢氧化钠水溶液使体系呈中性，在半透膜截留分子量为7000Da的条件下超纯水透析2d、透析液冷冻干燥获得聚赖氨酸接枝β‑环糊精衍生物；所述聚赖氨酸接枝β‑环糊精衍生物简称PLCD；所述聚‑L‑赖氨酸氢溴酸盐粘均分子量为15000～30000Da；以赖氨酸结构单元计的聚‑L‑赖氨酸氢溴酸盐、6‑醛基化β‑环糊精和氰基硼氢化钠的摩尔比为1:(0.5～2):4；(2)按质量比为1:(0.3～0.5)的比例，将PLCD与疏水性化疗药物溶解于二甲基亚砜中，室温搅拌8～12h，在半透膜截留分子量为8000～14000Da的条件下纯水透析24h、冷冻干燥，得到载化疗药物的纳米粒子；(3)将载化疗药物的纳米粒子与核酸分别溶于DEPC水中，调节两种溶液的浓度使载化疗药物的纳米粒子与核酸的N/P摩尔比为30～50:1，将二者等体积混合，涡旋震荡20～30s，经室温静置孵育30～60min，得共载化疗药物和核酸的纳米粒子；(4)将共载化疗药物和核酸的纳米粒子滴加于质量浓度为0.75～1.0mg/mL的透明质酸水溶液中，在200‑400rpm的条件下，搅拌5‑10min，得共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子；透明质酸与共载化疗药物和核酸的纳米粒子的质量比为(3～4):6。...

【技术特征摘要】
1.一种共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子的制备方法，其特征是包括如下步骤：(1)将6-醛基化β-环糊精、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐溶于pH＝4.4的醋酸盐缓冲溶液中，室温搅拌1-2h，加入氰基硼氢化钠，室温继续搅拌48～72h；加氢氧化钠水溶液使体系呈中性，在半透膜截留分子量为7000Da的条件下超纯水透析2d、透析液冷冻干燥获得聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物；所述聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物简称PLCD；所述聚-L-赖氨酸氢溴酸盐粘均分子量为15000～30000Da；以赖氨酸结构单元计的聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、6-醛基化β-环糊精和氰基硼氢化钠的摩尔比为1:(0.5～2):4；(2)按质量比为1:(0.3～0.5)的比例，将PLCD与疏水性化疗药物溶解于二甲基亚砜中，室温搅拌8～12h，在半透膜截留分子量为8000～14000Da的条件下纯水透析24h、冷冻干燥，得到载化疗药物的纳米粒子；(3)将载化疗药物的纳米粒子与核酸分别溶于DEPC水中，调节两种溶液的浓度使载化疗药物的纳米粒子与核酸的N/P摩尔比为30～50:1，将二者等体积混合，涡旋震荡20～30s，经室温静置孵育30～60min，得共载化疗药物和核酸的纳米粒子；(4)将共载化疗药物和核酸的纳米粒子滴加于质量浓度为0.75～1.0mg/mL的透明质酸水溶液中，在200-400rpm的条...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋天强，熊青青，
申请(专利权)人：天津市肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：天津,12