本发明专利技术提供一保存及萃取核酸的双效溶液，尤其是保存及萃取核糖核酸的双效溶液，该溶液不仅可保存试样避免试样中核酸的降解，而且可用于纯化存在试样中的核酸。例如，当使用该技术中公知的纯化步骤时，此双效溶液可应用在保存并稳定粪便并萃取其中细胞所含的核糖核酸分子，由此去除粪便中的杂质，使所得到的核糖核酸产物可以顺利进行下游实验。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种在进行核酸纯化前尤其是核糖核酸纯化前保存细胞核糖核酸的试剂与方法，并可用于萃取细胞内核糖核酸。此外并不需要保存在低温环境中。
技术介绍
核糖核酸因为很容易被环境中所存在的核糖核酸酶分解，所以核糖核酸在一般环境下能完整存在的时间很短，保存上的稳定度远比脱氧核糖核酸低，故长久以来，如何得到高品质及完整的核糖核酸一直是进行许多基础分生实验上欲解决的重要问题。完整的核糖核酸不但可使反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)容易成功，对于北方墨点杂交、核酸酶保护分析实验等皆扮演关键角色。近年来，由于分子生物技术逐渐应用于临床鉴定或是检验上，研究人员或医护人员必须在最短时间内以最适当地条件将临床样本送至研究单位或检验单位，以保存其中的重要指标物质-核糖核酸使不被降解，进而能顺利进行与基因表达相关的研究或检验。关于核糖核酸的保存技术，美国安比恩(Ambion)公司生产一种可保存完整细胞的溶液RNAlaterTM(美国专利第6,204,375号)，该产品包含25mM柠檬酸钠、10mM乙二胺四乙酸以硅胶珠作为干燥粪便的手段藉以保存、萃取与扩增粪便中的DNA。在Loktionov et al.，Clin.Cancer Res.4(2)337-42，Feb.1998中则是从人类粪便表面分离剥落的大肠细胞(colonocytes)检测特定脱氧核糖核酸(DNA)，希望作为大肠癌的筛检工具。Ahlquist D.A.et al.，Gastroenterology 119(5)1219-1227，Nov.2000亦通过检测粪便中产生变化的人类DNA作为大肠癌的筛检。美国专利第6,268,136号涉及粪便样本的制备以产生大量的DNA，分析标的DNA而依循作为大肠癌的指标。Alexander R.J.et al.，Digestive Disease and Sciences43(12)2652-2658，Dec.1998涉及从人类粪便样本纯化总核糖核酸的方法，其说明了如何从新鲜粪便抽取总核糖核酸。该方法使用研钵将粪便在液态氮急速冷冻情形下研磨0.6至1克的粪便，最后加入2～3毫升的10mM Tris-HCl(pH7.4)，200mM氯化钠与1mM EDTA溶解并进行离心，但在该文献中仍是使用液态氮的方式研磨样本进行核糖核酸的纯化，也未提及如何保存粪便中的核糖核酸。因此，需要一种在一般温度下可以方便保存微量细胞并从其中萃取出高品质且完整的核糖核酸的试剂与方法。
技术实现思路
为了能够早期以非侵入性的方法检测出体内细胞核糖核酸表现是否产生变化，而且可以不需亲自到医院去提供检测的试样，并将试样的运送便利化，使收取到的试样能够容易进行后续的纯化萃取步骤。因此本专利技术的一个目的是提供一种核糖核酸保存/萃取的双效缓中液，该核糖核酸保存/萃取双效缓冲液，包含离液(chaotropic)物质与至少一盐类，该保存/萃取双以硅胶珠作为干燥粪便的手段藉以保存、萃取与扩增粪便中的DNA。在Loktionov et al.，Clin.Cancer Res.4(2)337-42，Feb.1998中则是从人类粪便表面分离剥落的大肠细胞(colonocytes)检测特定脱氧核糖核酸(DNA)，希望作为大肠癌的筛检工具。Ahlquist D.A.et al.，Gastroenterology 119(5)1219-1227，Nov.2000亦通过检测粪便中产生变化的人类DNA作为大肠癌的筛检。美国专利第6,268,136号涉及粪便样本的制备以产生大量的DNA，分析标的DNA而依循作为大肠癌的指标。Alexander R.J.et al.，Digestive Disease and Sciences43(12)2652-2658，Dec.1998涉及从人类粪便样本纯化总核糖核酸的方法，其说明了如何从新鲜粪便抽取总核糖核酸。该方法使用研钵将粪便在液态氮急速冷冻情形下研磨0.6至1克的粪便，最后加入2～3毫升的10mM Tris-HCl(pH7.4)，200mM氯化钠与1mM EDTA溶解并进行离心，但在该文献中仍是使用液态氮的方式研磨样本进行核糖核酸的纯化，也未提及如何保存粪便中的核糖核酸。因此，需要一种在一般温度下可以方便保存微量细胞并从其中萃取出高品质且完整的核糖核酸的试剂与方法。
技术实现思路
为了能够早期以非侵入性的方法检测出体内细胞核糖核酸表现是否产生变化，而且可以不需亲自到医院去提供检测的试样，并将试样的运送便利化，使收取到的试样能够容易进行后续的纯化萃取步骤。因此本专利技术的一个目的是提供一种核糖核酸保存/萃取的双效缓中液，该核糖核酸保存/萃取双效缓冲液，包含离液(chaotropic)物质与至少一盐类，该保存/萃取双管，直立置于室温(25℃)6天(144小时)后，加入一小匙的玻璃珠(约5至10颗，直径2～4厘米)与3毫升的核糖核酸保存/萃取双效缓冲液，再进行下述核糖核酸抽取步骤。核糖核酸的抽取纯化将已加入玻璃珠与核糖核酸保存/萃取双效缓冲液的样本于50毫升离心管内强烈震荡15分钟，使样本充分分散并溶解于缓冲液中，接着以离心机在12,000g、4℃下离心一分钟。取出离心管内2毫升以上清液至15毫升的离心管中，加入6毫升商品化核糖核酸纯化溶液BLUE EXTRACT(浊水溪生物科技公司，台湾)根据成套设备纯化指示进行后续核糖核酸纯化至异丙醇沉淀步骤为止，但是在以异丙醇沉淀的步骤之前另外加上以等体积的酚/三氯甲烷萃取两次。接着，使经过异丙醇沉淀后所取得的沉淀物溶于经过焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水(DEPC-H2O)100微升(μl)及台湾富联生物料技公司(VIOGENE-BIOTEK CORP.)所生产的核糖核酸萃取成套设备“Total RNA Extraction Miniprep System”内所附的RX buffer 350μl与纯酒精250μl，并放入总核糖核酸管柱(Total RNA Mini Column)，之后依照该公司所推荐的流程进行后续核糖核酸的纯化。以上述方法，由两位受试者粪便中抽出核糖核酸，测量其O.D值，换算所抽到的总核糖核酸浓度如下(平均值)由本专利技术所制备纯化的核糖核酸，测其在波长260nm与做调整；或例如加入二价阳离子螯合剂以使核糖核酸酶失去活性，该螯合剂可为一般使用的乙二胺四乙酸、乙二醇双乙胺醚-N，N’四乙酸(EGTA)或是任何可将二价阳离子抓离核酸酶的物质。亦可加入消解蛋白质双硫键的物质，例如一些可将双硫链链结还原的还原剂，消解蛋白质双硫键的目的是为了使存在于溶液中形成核糖核酸酶的胺基酸链形成双硫键的部分加以还原分开，使之失去原本的二级结构，让核糖核酸酶失去活性，较佳为使用β-巯基乙醇或二硫苏糖醇等。为促进样本中所含细胞溶于缓冲液中，还可添加可促使样本分散的物质例如玻璃珠粒。该玻璃珠粒可在纯化核糖核酸时帮助样本的分散，譬如通过震荡装有玻璃珠粒与缓冲液和样本的容器，使珠粒振击样本以使样本分散。添加珠粒的数量可以根据要保存粪便的硬度或是保存日数来决定。保存时间越长，在保存缓冲液中的样本就越松散，助于样本分散的珠粒数目便可以越少。为维持缓冲液pH值的稳定性，可加入一些稳定pH值的物质例如柠檬酸钠、醋酸钠、柠檬酸钾、醋酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种保存／萃取核糖核酸的双效缓冲液，包含离液物质与至少一盐类，该保存／萃取双效缓冲液具有总盐类浓度在１０克／１００毫升与该盐类的饱和浓度间，且该保存／萃取双效缓冲液可将核糖核酸保存在大于－２０℃。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄纪榕，张刚玮，
申请(专利权)人：达湾生化科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]
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