一种同源精子诱导中华鲟雌核发育的方法技术

本发明专利技术属于人工诱导中华鲟单性生殖领域，特别是涉及一种遗传灭活的中华鲟同源精子诱导中华鲟卵子进行雌核发育的方法。包括中华鲟精子遗传物质灭活、中华鲟卵采集及中华鲟精子的授精操作、中华鲟受精卵的染色体加倍处理、雌核发育诱导卵的培育、雌核发育苗种的鉴定方法。利用本发明专利技术可以生产高度纯合的中华鲟苗种，为中华鲟全基因组测序研究提供实验材料，为生产单一性别中华鲟苗种提供种源，并且为揭示中华鲟性别决定机制提供材料和进一步研究单性繁殖保护提供技术支持。

Method for inducing female sturgeon nuclear development by homologous sperm

The invention belongs to the field of artificially induced Chinese sturgeon single sex reproduction, in particular to a method for inducing the development of Chinese sturgeon eggs by genetic inactivation of the homologous sperm of the Chinese sturgeon. Including the Chinese sturgeon sperm genetic material, inactivated sturgeon sturgeon sperm egg collection and insemination, Chinese sturgeon zygote chromosome doubling, gynogenesis gynogenetic egg cultivation, seed identification method. The invention can produce highly homozygous Chinese sturgeon larvae, to provide experimental materials for whole genome sequencing of Chinese sturgeon, providing a source for the production of single sex of Chinese sturgeon larvae, and to reveal the Chinese sturgeon sex determining mechanism and provide materials for further research to provide technical support for the protection of unisexual reproduction.

【技术实现步骤摘要】
一种同源精子诱导中华鲟雌核发育的方法
本专利技术属于人工诱导中华鲟单性生殖领域，特别是涉及一种遗传灭活的中华鲟同源精子诱导中华鲟卵子进行雌核发育的方法。
技术介绍
中华鲟是我国特有的一种古老的大型鱼类，体型大、生长快、肉质好，尤其其鱼籽大是鲟鱼中的珍品。中华鲟属于国家一级保护动物，在2010年被世界自然保护联盟(IUCN)列入极度濒危保护物种。中华鲟属于典型的两性生殖鱼类，也就是自然状态下需要成熟的雌鱼和雄鱼才能繁殖。中华鲟的性成熟时间长，雄性至少需要8-10年以上，雌性至少需要12-14年以上时间。中华鲟的性别比例为1:1，且无第二性征，在早期无法辨别性别。在中华鲟繁殖保护上希望养殖中尽可能多为雌鱼以便于快速生产更多的放流苗种，迅速恢复野外种群，以最小的投入产生最大的保护效益。而正常的两性生殖的方式无法繁殖出较高比例的雌性苗种。雌核发育是一种单性生殖方式，就是仅仅依靠卵子的遗传物质发育成为后代的生殖方式。目前自然界中有一部分鱼存在自发雌核发育的情况，例如分布于我国黑龙江的方正银鲫在繁殖季节会借助鲤鱼精子刺激进行雌核发育繁殖，然而其它多数两性生殖的鱼类很难进行大规模的自发雌核发育研究，但可以通过人工诱导的方式进行单性生殖。目前人工诱导雌核发育是快速生产单性苗种(例如全雌性或多数雌性苗种的一种方式)、快速产生高度纯系子代、进行极度濒危物种保护的一种方式。在俄罗斯鲟、高首鲟、闪光鲟、密西西比铲鲟、欧洲鳇、小体鲟、西伯利亚鲟、匙吻鲟、杂交鲟等鲟鱼的人工诱导雌核发育已有报道，尚没有关利用中华鲟精子诱导中华鲟雌核发育研究进行报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用遗传灭活的中华鲟精子诱导中华鲟卵子进行单雌性繁殖的方法，由本专利技术技术成功培育出了中华鲟雌核发育苗种。该技术可以快速生产高度纯合的中华鲟苗种，为进一步揭示中华鲟性别决定机制、生产单雌性苗种及为中华鲟全基因测序研究和进一步探索单性生殖保护技术具有重要的意义。本专利技术技术方案如下：(1)中华鲟精子遗传物质的灭活：采集中华鲟精子，选取活力在80％以上的中华鲟精子与精子稀释液混合，于0-2℃预冷的培养皿中，进行紫外线灭活；(2)中华鲟卵子采集及与中华鲟灭活精子授精：选择成熟的中华鲟雌鱼，水温18-19.5℃，人工注射LHRH-A2催产，在效应时间来临时采用腹部挤压的方法采集卵子，用所述步骤(1)灭活后精子进行授精，精子洒在卵上进行卵受精，加入养殖用水摇匀，再加水洗涤，放入含有滑石粉养殖用水的脱粘瓶中进行充气脱粘处理；(3)热休克加倍处理：在步骤(2)脱粘处理一段时间后，进行热休克处理；(4)雌核发育卵的培育：步骤(3)结束后的卵继续脱粘，脱粘结束后放入喷淋式孵化筛进行孵化培育；(5)雌核苗的分子鉴定：利用微卫星DNA标记筛选的方法，筛选使用灭活精子的亲鱼特异等位基因的微卫星位点，不少于两对；完成同源精子诱导中华鲟雌核的发育。优选地，所述步骤(1)精子紫外遗传灭活是在0-2℃低温环境下操作，经稀释后的中华鲟精液放置于在冰上预冷培养皿中，厚度≤1mm。进一步优选地，：所述精子稀释有两种方式，一种方式是利用中华鲟精液经过3000-5000g离心力离心3-5分钟的上清液作为精子稀释液进行中华鲟精子稀释，中华鲟精子与上清液的体积比为1:2-1:5；另一种方式是配置与中华鲟精子等渗透压的稀释液进行稀释，中华鲟精子与等渗透压稀释液的体积比为1:2～1:4，所述等渗透压的稀释液为：蔗糖20-100mmol/L，20mmol/LTris-HCl，KCl1-2mmol/L，pH8.5。优选地，所述步骤(2)采集后的卵子暂放在干燥光滑的盆子中用湿毛巾覆盖保持湿度，在18-19.5℃暂时保存。优选地，所述步骤(1)紫外线灭活方法为将培养皿置于铺有碎冰的摇床上，震荡频率为60-90rpm，在无菌操作台的紫外灯照射度为335.6μw/cm2，照射时间7-8分钟时间，紫外灯功率为20W，波长为254nm。优选地，所述步骤(2)授精方法为以1mL配比500-1000粒卵的比例，洒在卵上，之后加入1倍卵子体积的养殖用水摇匀1分钟，之后再加一倍的水洗涤，之后放入18-19.5℃含有10％-15％的滑石粉的养殖用水悬浊液的脱粘瓶中进行充气脱粘处理。优选地，所述步骤(3)热休克加倍处理方法为，受精卵在水温18℃脱粘处理17.5-18.9分钟(中华鲟在18℃的卵裂时间τ为70min，脱粘处理＝0.25τ-0.27τ＝17.5-18.9分钟)后进行热休克处理，处理的温度范围在35-38℃，持续时间为2min。优选地，所述步骤(4)放入喷淋式孵化筛进行培育，孵化水温为18-19.5℃。优选地，所述方法中步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)总时间为50-70分钟。本专利技术技术原理：成熟的卵子具有在一定的外界刺激下(比如机械刺激、电刺激、化学刺激和遗传灭活的精子刺激)可以启动发育，进行细胞分裂和后继的发育成为成熟的个体的潜力，但是卵细胞中遗传物质为的体细胞的一半，刺激发育的卵子进行增生的后代细胞中的遗传物质DNA含量为体细胞的一半，这样发育出的个体是单倍体，单倍体会表现出个体小、畸形、发育到一定阶段致死的特征。因此还要通过一定的技术手段在卵子发育的早期进行遗传物质加倍处理，使得发育中每个细胞的DNA的含量恢复到母本体细胞的水平，这样雌核发育的后代才是正常个体。采用同源精子生产出的雌核苗种可以有效保证中华鲟物种的纯正性，避免异源精子微量遗传物质的渗入，尤其对于中华鲟全基因组测序研究具有重要的意义。本专利技术有益效果：1、利用本专利技术技术培育出的中华鲟雌鱼。可以通过后代雌雄比例判断初步判断中华鲟性别决定遗传机制是XY还是ZW型。如果是XY型，那么将产生全雌性(XX)的中华鲟苗种，进一步与遗传上雌性生理上是雄性(XX)的个体进行交配，将会生产出全雌性(XX)的中华鲟后代。该技术对于中华鲟种群的迅速扩大具有重要的意义。如果中华鲟是ZW性别决定机制决定，那么后代将会出现1：1雌性个体(WW)和雄性个体(ZZ)，这种超雌性个体与雄性个体进行交配后后代将全部是雌性后代(ZW)。2、该技术可以快速生产高度纯合的中华鲟苗种。该技术为进一步揭示中华鲟性别决定机制、生产单雌性苗种及中华鲟全基因组测序研究和进一步研究单性生殖保护技术具有重要的意义。3、紫外灭活使精子的遗传物质失去活性，以避免参与子代个体发育，又具有一定的活性保留刺激卵子发育的能力。4、滑石粉脱去受精卵表面的粘性，防止卵子粘连堆积在一起而导致受精卵缺氧窒息，并便于后期卵子发育观察和死卵的清理操作。5、热休克处理目的在于抑制受精卵的第二极体(1n)排出，从而使得雌核发育的卵子(n)后代恢复正常的体细胞倍性(2n)。热休克成功的关键主要是在于控制热休克处理的时机、温度和热处理持续时间。6、本申请方法中步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)总时间为50-70分钟，对总时间进行限定，消除受精卵相互粘性，避免受精卵粘连堆积造成卵子内部缺氧而死亡，受精卵在孵化时候更容易散开，使得每个受精卵与水充分接触，便于卵子内部与外界环境进行氧气和代谢物的交换，更有利于受精卵发育和提高存活率，也便于以后观察和死卵和发霉卵的剔除。7、采用适宜的精子稀释方式，利用精子上清液或等渗透压稀释液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同源精子诱导中华鲟雌核发育的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：（1）中华鲟精子遗传物质的灭活：采集中华鲟精子，选取活力在80%以上的中华鲟精子与精子稀释液混合，于0‑2℃预冷的培养皿中，进行紫外线灭活；（2）中华鲟卵子采集及与中华鲟灭活精子授精：选择成熟的中华鲟雌鱼，水温18‑19.5℃，人工注射LHRH‑A2催产，在效应时间来临时采用腹部挤压的方法采集卵子，用所述步骤（1）灭活后精子进行授精，精子洒在卵上进行卵受精，加入养殖用水摇匀，再加水洗涤，放入含有滑石粉养殖用水的脱粘瓶中进行充气脱粘处理；（3）热休克加倍处理：在步骤（2）脱粘处理一段时间后，进行热休克处理；（4）雌核发育卵的培育：步骤（3）结束后的卵继续脱粘，脱粘结束后放入喷淋式孵化筛进行孵化培育；（5）雌核苗的分子鉴定：利用微卫星DNA标记筛选的方法，筛选使用灭活精子的亲鱼特异等位基因的微卫星位点，不少于两对；完成同源精子诱导中华鲟雌核的发育。

【技术特征摘要】
1.一种同源精子诱导中华鲟雌核发育的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：（1）中华鲟精子遗传物质的灭活：采集中华鲟精子，选取活力在80%以上的中华鲟精子与精子稀释液混合，于0-2℃预冷的培养皿中，进行紫外线灭活；（2）中华鲟卵子采集及与中华鲟灭活精子授精：选择成熟的中华鲟雌鱼，水温18-19.5℃，人工注射LHRH-A2催产，在效应时间来临时采用腹部挤压的方法采集卵子，用所述步骤（1）灭活后精子进行授精，精子洒在卵上进行卵受精，加入养殖用水摇匀，再加水洗涤，放入含有滑石粉养殖用水的脱粘瓶中进行充气脱粘处理；（3）热休克加倍处理：在步骤（2）脱粘处理一段时间后，进行热休克处理；（4）雌核发育卵的培育：步骤（3）结束后的卵继续脱粘，脱粘结束后放入喷淋式孵化筛进行孵化培育；（5）雌核苗的分子鉴定：利用微卫星DNA标记筛选的方法，筛选使用灭活精子的亲鱼特异等位基因的微卫星位点，不少于两对；完成同源精子诱导中华鲟雌核的发育。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）精子紫外遗传灭活是在0-2℃低温环境下操作，经稀释后的中华鲟精液放置于在冰上预冷培养皿中，厚度≤1mm。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述精子稀释有两种方式，一种方式是利用中华鲟精液经过3000-5000g离心力离心3-5分钟的上清液作为精子稀释液进行中华鲟精子稀释，中...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜合军，刘雪清，陈磊，舒德斌，张建明，肖衎，胡亚成，赵珣，姜华，郭柏福，
申请(专利权)人：中国长江三峡集团公司中华鲟研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42