马鞭草提取物及其制法和用途制造技术

一种马鞭草提取物，它是由中药材马鞭草全草用乙醇提取，浓缩乙醇提取液，加水，以石油醚提取，弃去石油醚提取液，水层用氯仿提取，蒸馏氯仿提取液所得的浸膏，即为本发明专利技术的马鞭草提取物。本发明专利技术公开了其制备方法。本发明专利技术的马鞭草提取物可以应用于制备抗早孕的药物及制备抗滋养层细胞肿瘤的药物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及马鞭草的提取物及抗早孕和抗滋养细胞肿瘤的药物。计划生育是我国的国策。由于目前尚无一种完善的避孕措施，故人工流产为避孕失败的一种必不可少的补救措施。据统计，我国每年约有1400万人次行人工流产术，人流虽然较安全、简便，但还有一定的并发症，对生殖道造成不同程度的机械损伤。抗早孕的化学药物有两种，一种为前列腺素(PG)，另一种为米非司酮(RU486)，两者合并应用有效率达88.8％。但由于该药价格较贵，合成工艺复杂；加之有较多的副反应，有时会引起不全流产乃至大出血。中草药是我国中医药学中的一大宝库，具有价格低、药源丰富之特点。自七十年代初开始对天花粉、旋复花等进行临床试验，并不断提纯。1987年以来应用结晶天花粉蛋白注射液抗早孕取得较好的效果，但孕妇需住院宫腔内给药，55.4％的病例有全身各种药物反应，病人较难接受，故而寻找一种理想的能替代人流术的药物是计划生育工作者的一项重要任务。中草药具有药源丰富、价格低的特点，虽然近年来有些临床应用的报道，但缺乏深入的研究。滋养细胞肿瘤(包括绒毛膜癌和侵蚀性葡萄胎)是妇科较为常见的疾病，绝大多数患者为生育年龄的妇女。其病理学特点是增生的滋养细胞大片侵蚀子宫肌层及血管，早期发生全身转移，特别是肺转移及颅内转移，对妇女的健康及生命危害极大。50-60年代，此病的死亡率很高，文献统计绒毛膜癌的死亡率为90％以上，侵蚀性葡萄胎的死亡率在25％以上，并且大多患者因行子宫切除而丧失生育能力。自有效的化疗药物问世以后，使此病的死亡率显著下降。单纯化疗对于有生育要求患者而言是有利的，但近年来随着难治性、多药耐药性滋养细胞肿瘤的增多，常导致治疗失败。加之早期即可血行转移，局部手术达不到根治的目的。目前临床对恶性滋养细胞肿瘤的治疗仍以化疗为主，如5-Fu、5-MP、MTX等，化疗药物副作用大，耐药患者需多种药物同时反复注射，对造血、心、肝、肾功能造成严重的损伤。在我国医院收治的水泡状胎块(葡萄胎)患病率占妊娠总人数的0.6％，再次患病率增至3.74％，近年文献报道葡萄胎的恶变率为10％-20％之间。故而寻找一种抗滋养细胞肿瘤，抗耐药或延迟耐药的出现，预防良性葡萄胎恶变的有效药物是广大医药科技人员研究的热点。目前，国内外对滋养细胞肿瘤的治疗仍为化疗、手术、放疗及免疫疗法，其中以化疗和手术疗法为主。大多研究内容为联合化疗药物的配伍，治疗剂量及用药时间的间隔。发掘祖国传统中药，寻找一种抗滋养层细胞肿瘤的有效药物研究近10年文献检索中未见报道。一种制备上述的马鞭草提取物的方法，它由下列步骤组成步骤一、将马鞭草全草Wkg，用3W～8Wkg95％乙醇加热至沸，回流提取3小时，冷却，过滤，滤渣再用3W～8Wkg95％乙醇加热至沸，回流提取3小时，冷却，过滤除去沉淀，合并乙醇提取液，减压蒸馏回收乙醇(压力范围为0.08～0.09MPa，温度范围为60℃～70℃)，至无醇味，加水至0.15～0.25W升，使每毫升相当3.3～6.5生药，步骤二、将步骤一制得的乙醇提取物水溶液每次加0.1～0.3W升石油醚萃取3～4次，弃去石油醚萃取液，保留水溶液，步骤三、将步骤二所得的水溶液每次用0.1～0.3W升氯仿提取3～4次，合并氯仿提取液，减压蒸馏(压力范围为0.08～0.09MPa，温度范围为55℃～65℃)回收氯仿至无氯仿蒸出，得浸膏，即为本专利技术的马鞭草提取物。上述的制备方法中，所述的石油醚是60～90℃的石油醚。本专利技术的马鞭草提取物可以应用于制备抗早孕的药物。本专利技术的马鞭草提取物可以应用于制备抗滋养层细胞肿瘤的药物。本专利技术人以下列方法观察本专利技术的马鞭草提取物的药用价值以体外培养人早孕绒毛分离纯化的滋养层细胞及人绒毛膜癌JAR细胞为实验手段，应用细胞增殖抑制试验(MTT比色法)、3H-TdR及荧光显色法来观察本专利技术的马鞭草提取物对细胞的抑制作用；将本专利技术的马鞭草提取物给早孕小鼠灌服，观察其对孕鼠子宫、胎盘及胎鼠的影响；建立裸鼠人绒毛膜癌实体瘤的动物模型，观察本专利技术的马鞭草提取物的抗肿瘤的体内效果。通过以上实验方法表明本专利技术的马鞭草提取物，对人早孕绒毛分离纯化的滋养层细胞有明显的抑制细胞增殖作用，HCG的分泌与对照组相比明显减少，并呈时间及剂量依赖；能使孕鼠胎盘滋养层细胞及蜕膜细胞染色质边聚，核空泡化，细胞固缩等退行性改变，明显抑制胚胎生长；对人绒毛膜癌JAR细胞有抑制增殖、促细胞凋亡的作用；裸鼠人绒毛膜癌实体瘤的动物模型，观察到了有抑制瘤体的发生、发展及延长荷瘤模型的生存时间，具有较为理想的体内作用。四附图说明图1为培养对照组绒毛组织HCG免疫组化(合体滋养细胞内有反应强棕黄色阳性颗粒)×400的显微照片；图2为加马鞭草提取物培养48小时后绒毛组织HCG免疫组化(阳性部位反应明显减弱)×400的光镜照片；图3为培养对照组绒毛组织SDH酶组化(合体滋养细胞表面见兰色阳性颗粒)×400的光镜照片；图4为加马鞭草提取物培养48小时后绒毛组织SDH酶组化(阳性部位反应减弱)×400的光镜照片；图5为培养48小时后人肝癌SMMC-7721细胞株×400的比相倒置显微镜照片；图6为加马鞭草提取物后48小时人肝癌SMMC-7721细胞株×400的比相倒置显微镜照片； 图7为培养48小时后人胚肺二倍体成纤维细胞株(2BS)×400的比相倒置显微镜照片；图8为加马鞭草提取物后48小时2BS×400的比相倒置显微镜照片；图9为马鞭草提取物组的孕鼠子宫与对照组相比明显改变；图10为马鞭草提取物组与对照组胎鼠的比较，其中a为米非司酮组，b为马鞭草提取物组，c为对照组；图11为加马鞭草提取物后24小时，JAR细胞(可见中央部分细胞死亡)×400的比相倒置显微镜照片；图12为加马鞭草提取物后48小时，JAR细胞(可见大片细胞死亡)×400的比相倒置显微镜照片；图13为3H-TdR掺入法显示加马鞭草提取物后对JAR细胞的抑制作用，其中，1为对照组；2为低剂量加药组；3为中剂量加药组；4为高剂量加药组；图14为对照组JAR细胞EGFR表达免疫组化染色(胞质、核膜见棕色反应物)×400的光镜照片；图15为20mg/mL马鞭草提取物作用48小时JAR细胞EGFR表达免疫组化染色(阳性反应物减少)×400的光镜照片；图16为对照组JAR细胞荧光染色(兰色为活细胞，红色为死细胞)×200的荧光显微镜照片；图17为加马鞭草提取物后24小时JAR细胞荧光染色(死细胞数量增多)×200的荧光显微镜照片；图18为加马鞭草提取物后48小时JAR细胞荧光染色(死细胞数量更多)×200的荧光显微镜照片；图19为加马鞭草提取物后72小时JAR细胞荧光染色(细胞大多死亡)×200的荧光显微镜照片；图20为JAR细胞荧光染色的荧光显微镜照片，其中a为活细胞×200，b1为早期凋亡细胞×200，b2为早期凋亡细胞×400，c为晚期凋亡细胞×400，d为凋亡细胞核呈碎片状；图21为早期凋亡细胞电镜像×14000，染色质边聚，核呈空泡状，线粒体髓样改变； 图22为凋亡细胞电镜像×6000，见凋亡小体(↑)；图23为培养48小时后对照组JAR细胞流式分析图；图24为加马鞭草提取物后48小时JAR细胞流式分析图，见明显的凋亡峰；图25为裸鼠人本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种马鞭草提取物，其特征是它是由中药材马鞭草全草用乙醇提取，浓缩乙醇提取液，加水，以石油醚提取，弃去石油醚提取液，水层用氯仿提取，蒸馏氯仿提取液所得的浸膏，即为本专利技术的马鞭草提取物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐昌芬，曾群，徐珊，罗莉，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]