一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法技术

本发明专利技术属于转基因技术领域，具体公开了一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法。本发明专利技术将携带有Hsp70启动子驱动的溶菌酶C3基因的Tgf2 转座子引入到罗非鱼受精卵内，利用转座子的转座特性将Hsp70启动子和溶菌酶C3基因一起整合到罗非鱼的基因组上，得到能够诱导表达罗非鱼溶菌酶C3的罗非鱼新品系。这一技术不仅能提高罗非鱼的免疫力，达到育成具有较强抗病力的罗非鱼新品种，而且还是首次将Tgf2 转座子引入到转基因罗非鱼的构建中，为养殖鱼类导入外源基因开辟了新的方法，具有重要的理论意义和应用价值。

Preparation method of transgenic lysozyme gene tilapia

The invention belongs to the field of transgenic technology, in particular to a method for preparing transgenic tilapia with lysozyme gene. The present invention will carry Hsp70 gene promoter driven C3 lysozyme promoter Tgf2 transposon into tilapia oosperm, using transposition characteristics of transposon Hsp70 promoter and C3 gene with lysozyme integrated into the genome of tilapia, tilapia can get new strains of tilapia lysozyme induced expression C3. This technology not only can improve the immunity of tilapia, tilapia to breeding new species with strong resistance to disease, but also for the first time Tgf2 transposon is introduced into the construction of transgenic tilapia, provides a new method for exogenous fish genes, has important theoretical significance and application value.

【技术实现步骤摘要】
一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法
本专利技术涉及转基因
，具体公开了一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法。
技术介绍
罗非鱼隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(Tilapia)，是一种世界性的养殖鱼类。但近年来，由于养殖密度高、养殖环境恶化等原因，养殖罗非鱼暴发了链球菌病，导致养殖罗非鱼的大量死亡，造成巨大的经济损失并威胁着罗非鱼养殖业的健康发展。因此，需要建立一种能有效抵御链球菌病的罗非鱼新品系。转基因是一种快速高效的改良水产养殖品种性状的方法，关于转基因的方法有很多，而转座子转基因技术因为其操作方便且整合效率高而得到广泛应用。Tgf2转座子是迄今为止在鱼类中发现的第二例有活性的转座子，能高效地介导目的基因与受体基因组的整合与遗传。目前关于Tgf2转座子报道多集中在产生带红色荧光蛋白标记的团头鲂和斑马鱼，但未见利用Tgf2转座子制备抗病转基因罗非鱼的相关报道。现有技术中关于转基因罗非鱼的报道一直都很少见，原因在于，罗非鱼特殊的繁殖特点导致了体外获得罗非鱼刚受精的卵是非常困难的。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术中难于体外获得刚受精的罗非鱼卵的困难，导致转基因罗非鱼制备受限制的技术缺陷，提供一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案步骤如下：S1.构建携带罗非鱼Hsp70启动子和溶菌酶C3基因的Tgf2转座子质粒；S2.获取产卵后1小时以内、处于单细胞时期的罗非鱼受精卵，具体方法为：将雌性罗非鱼进行室内饲养，控制温度25~30℃，每天14小时的光照，10小时的黑暗，每周投喂二次维生素E；观察、掌握雌性罗非鱼的产卵周期；对处于产卵期的雌性罗非鱼进行人工挤卵，与挤出的雄性罗非鱼的精液混合获得处于单细胞时期的刚受精的罗非鱼卵；S3.将S1所述的Tgf2转座子质粒和能够提供转座酶的mRNA一起导入罗非鱼的受精卵中，得转基因F0代罗非鱼；S4.当F0代罗非鱼长至二月龄时，剪取鳍条提DNA，PCR检测，筛选出阳性个体，待阳性个体饲养至成鱼后与野生罗非鱼交配续代，即得到转基因F1代罗非鱼，再对转基因F1代罗非鱼进行阳性率检测，筛选得到能稳定遗传Hsp70与溶菌酶C3基因的转基因罗非鱼。罗非鱼在繁殖过程中，雌性罗非鱼将受精卵含在嘴里孵化，孵出小鱼后再吐出来。即雌鱼排卵的同时，雄鱼排精，卵子完成受精后被随即被雌鱼含在口腔中。正是由于罗非鱼这一特殊的生殖方式，导致了难于获得刚受精的罗非鱼卵即处于单细胞期的受精卵以供显微注射。另外罗非鱼的产卵时间和周期会受到营养及外界环境（如温度、光照等）的影响，人工很难准确把握罗非鱼的产卵时间。本专利技术首先研究出一种准确获取刚受精的罗非鱼卵的方法，在获取刚受精的罗非鱼卵的基础上，再利用Tgf2转座子将Hsp70启动子和溶菌酶C3基因一起整合到罗非鱼的基因组上，得到能够诱导表达罗非鱼溶菌酶C3的罗非鱼新品系。从而提高罗非鱼的抗病菌能力。所述携带罗非鱼Hsp70启动子和溶菌酶C3基因的Tgf2转座子质粒包含有Tgf2转座子的2个转座臂、Hsp70启动子、C型溶菌酶基因3和SV40的多聚腺苷酸识别序列，辅助质粒包含Tgf2转座子的转座酶基因。本专利技术在制备得到转基因F0代罗非鱼后，将其培育达性成熟后，通过与野生型罗非鱼交配，获得能够稳定遗传Hsp70与溶菌酶C3基因的转基因罗非鱼F1代，进而性成熟的F1代个体间配对即可获得F2代转C3基因的罗非鱼。现有技术中在制备转基因鱼时，转植基因的整合率与可遗传率都偏低，因此通常难于获得可遗传品系。本专利技术借助转座子技术所制备的转溶菌酶C3罗非鱼，经过连续2代的传代筛选，已获得了能够稳定遗传的品系。不同类型的溶菌酶的抗菌能力不同，不同鱼类来源的溶菌酶的抗菌能力也不同，优选地，本专利技术所述溶菌酶C3基因为奥利亚罗非鱼的溶菌酶C3基因，经前期实验验证其对无乳链球菌（GBS）等的溶菌能力较强。优选地，本专利技术所述罗非鱼受精卵为尼罗罗非鱼的受精卵。所述的采用显微注射转植基因的方法的注射时间是产卵后1小时以内、处于单细胞时期的罗非鱼受精卵，优选地，显微注射的Tgf2转座子的浓度为50ng/μl，转座酶的mRNA的浓度为100ng/μl，每粒受精卵的注射体积为2nl。转溶菌酶基因罗非鱼的挑选和验证方法为：剪取二月龄转基因罗非鱼鳍条提取DNA，在Hsp70启动子上设计上游引物，在溶菌酶C3上设计下游引物，上游引物和下游引物的序列如SEQIDNO：3~4所示。用上述引物对所提DNA进行PCR扩增。电泳检测PCR结果是否出现阳性带，如果出现就判定为该鱼体为转基因阳性，如果没有阳性带，则判定为该鱼体为阴性个体。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首先研究出一种准确获取刚受精的罗非鱼卵的方法，在获取罗非鱼刚受精的卵的基础上，再利用Tgf2转座子将Hsp70启动子和溶菌酶C3基因一起整合到罗非鱼的基因组上，得到能够诱导表达罗非鱼溶菌酶C3的罗非鱼新品系。从而提高罗非鱼的抗病菌能力。本专利技术利用PCR检测方法筛选转基因罗非鱼阳性个体，这种转C3溶菌酶的罗非鱼能够提升罗非鱼的免疫力，达到育成具有抗病能力罗非鱼新品种，为对抗罗非鱼日益严重的病害提出的新的解决方案和对策。另外，开拓了Tgf2转座子应用于罗非鱼的先河，为拓宽转基因鱼的研究空间打下坚实基础。附图说明图1是Tgf2转座子质粒的结构图。图2是F0代转基因鱼PCR检测结果之一。图3是F1代转基因鱼PCR检测结果之一。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作详细的说明，但是实施例记载的范围不会对本专利技术的保护范围做任何形式的限制。实施例中使用的试剂、设备为本
常规试剂和设备，实施例中未详细说明的分子生物学方法可参考本领域常规技术方法。实施例1：转基因供体质粒pTgf2-Hsp70-C3的构建以奥里亚罗非鱼cDNA为模板，采用带有酶切位点的溶菌酶C3-F（AgeI）和C3-R（ClaI）为引物，利用PrimeSTARHSDNAPolymerase（TAKARA公司）进行PCR扩增溶菌酶C3基因，条带纯化、回收后克隆到载体pUM19-T质粒上，酶切、测序鉴定获得pUM19-T-C3重组质粒。然后用AgeⅠ和ClaⅠ双酶切pUM19-T-C3重组质粒，回收C3目的片段。对实验室先前构建保存的pTgf2-Hsp70-eGFP质粒用限制性内切酶AgeI和ClaI进行双酶切，切除pTgf2-Hsp70-eGFP质粒中的eGFP片段，回收载体骨架片段。把得到的载体骨架片段与回收的C3目的片段，用T4连接酶进行连接，转化到感受态大肠杆菌DH5α中，挑取菌落，在氨苄抗性LB液体培养基中培养，取1µL菌液进行PCR验证，阳性克隆送测序确定结果。酶切、测序鉴定获得pTgf2-Hsp70-C3表达质粒。扩增带有酶切位点的溶菌酶C3所用的引物如下：引物C3-F序列：CCACCGGTCGCCACCATGAGGAGTGTGTTTGTTT引物C3-R序列：CCATCGATTTAAAGACGACATCCGGACAAATAG现有技术中，转基因研究中通常选用的管家基因启动子如β-actin以及elongationfactor(EF)启动子可能导致外源基因在各组织中过量表达，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.以pTgf2-Hsp70-eGFP为出发质粒构建携带罗非鱼Hsp70启动子和奥里亚罗非鱼溶菌酶C3基因的Tgf2转座子质粒；S2.获取产卵后1小时以内、处于单细胞时期的罗非鱼受精卵，具体方法为将雌性罗非鱼进行室内饲养，控制温度25~30℃，每天14小时的光照，10小时的黑暗，每周投喂二次维生素E；观察雌鱼的繁殖活动，定期检测雌性罗非鱼口中是否含有卵，记下雌性罗非鱼每一次产卵的时间，掌握雌性罗非鱼的产卵周期；对处于产卵期的雌性罗非鱼进行人工挤卵，与挤出的雄性罗非鱼的精液混合获得处于单细胞时期的刚受精的罗非鱼卵；S3.将S1所述的Tgf2转座子质粒和能够提供转座酶的mRNA一起导入罗非鱼的受精卵中，得转基因F0代罗非鱼；S4.当...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶星，孙成飞，董浚键，瞿兰，卢迈新，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44