用于低聚核苷酸合成的合成子制造技术

本发明专利技术涉及亚磷酰胺化合物，尤其是三价磷多聚体，使用三价磷多聚体制备低聚核苷酸的方法，以及制备三价磷多聚体的方法。此外，本发明专利技术还涉及用三价磷多取体衍生形成的一种固体载体及其制备方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
合成的低聚核苷酸在诊断领域对于检测遗传性和病毒性疾病是重要的。此外，自从美国食品和药物管理局批准一种低聚核苷酸类似物用于治疗巨细胞病毒(CMV)以来，大规模合成用于反义疗法和相关疗法的低聚核苷酸已变得日益重要，几种其它的低聚核苷酸目前正在临床试验。每项临床试验需要千克数量级的纯化的低聚核苷酸类似物。已经发现，在核苷酸之间含改性键，例如硫代磷酸酯键或硫代磷酸酯键与磷酸二酯键的组合(嵌合式低聚核苷酸)的低聚核苷酸类似物，在反义疗法应用中比只含磷酸二酯键的低聚核苷酸更有用，因为它们更能耐受体内的降解。通常，低聚核苷酸类似物是以每次加上一个核苷酸单体的方式合成的，直到完成所要求的序列。每个核苷酸的加入都需要一个最少有三个反应步骤的循环一个偶合步骤，一个氧化或硫化步骤，以及一个5′-去保护步骤。一般还在氧化或硫化步骤之后进行一个封端步骤。因此，一个有21个碱基的低聚核苷酸的合成需要20次循环或60-80个反应(取决于每次循环后是否进行封端步骤)。因为每个反应步骤的产率一般小于100％，所以以高产率合成长的低聚核苷酸是困难的，而且，利用目前的技术来合成具有约150个以上核苷酸碱基的低聚核苷酸，即使不是不可能，也是非常困难的。另外，大数目的反应步骤耗费大量的试剂，使得合成更为昂贵。为了以高产率得到较长的低聚核苷酸和/或降低用于合成低聚核苷酸的试剂花费，最好是减少为合成低聚核苷酸所需的反应步骤数目。曾提出使用二聚或三聚体以增加产率和获得较长的合成低聚核苷酸的可能性。然而，目前使用的二聚体和三聚体带有已被氧化形成磷酸二酯键或硫化形成硫代磷酸酯键的磷键。因此，这些结构单元不如单体结构单元通用，使用相同的单体结构单元可以形成具有或是磷酸二酯主链，或硫代磷酸酯主链，或磷酸二酯与硫代磷酸酯组合主链的低聚核苷酸。合成之后通常要将低聚核苷酸与合成期间产生的杂质分离。一般，这些杂质包括反应试剂、副产物和失败序列。失败序列是其中一个或多个偶合步骤失败的情况下产生的低聚核苷酸，因此，失败序列比期望的长度要短一个或多个核苷酸。失败序列一般用离子交换色谱法去除。然而，只比期望长度短一个核苷酸的失败序列(即，N-1物种)难以去除，因为它与预期产物的结构类似性使其与产物低聚核苷酸具有相似的色谱迁移度。N-2和N-3失败序列更容易与预期产物分离，因为它们在结构上的差别足以使其具有与产物低聚核苷酸显著不同的色谱迁移度。因此，为了提高所要的低聚核苷酸的产率和纯度，希望有一种不产生N-1失败序列的合成方法。必须改进低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物的合成方法，以便以治疗应用所需的数量和质量制备这些化合物。此外，以适用的产率合成较长低聚核苷酸的能力可以扩展它们在治疗和重组体领域的应用。本专利技术的一个方面提供了一种亚磷酰胺化合物，其中含有通过一个或多个核苷间磷原子连接的两个或多个核苷部分，该核苷间磷原子是磷(III)原子。亚磷酰胺化合物包含一个亚磷酰胺部分，它可以结合到带有该亚磷酰胺部分的核苷部分的5′位或者最好是3′位上。亚磷酰胺部分优选是式-X1-PR3NR4R5基团，其中R3、R4和R5定义如下。核苷部分可以是d-或L-核苷，但在很多实施方案中是d-核苷。该核苷可以是无碱基的，但在很多实施方案中含有核碱基。通常，这些核碱基用本领域已知的合适的保护基保护。核苷磷(III)原子优选含亚磷酸三酯基团。在很多实施方案中，亚磷酸三酯基团将携带亚磷酰胺部分的核苷部分的5′-位和第二个核苷部分的3′-位连接。最好是，该亚磷酸三酯基团含有一个β-氰基乙氧基或β-氰基乙硫基部分。在另一方面，本专利技术提供了可用结构式I表示的一种三价磷多聚体或其立体异构物 在结构式I中，各X1独立地是-O-或-S-。各X2独立地是-O-、-S-或-NR-。各X3独立地是-O-，-S-，-CH2-，或-(CH2)2-。在一项优选的实施方案中，各X1、X2和X3是-O-。R1是保护基团，优选是酸不稳定的保护基团或三烷基甲硅烷基，例如叔丁基二甲基甲硅烷基或三异丙基甲硅烷基。在一项更优选的实施方案中，R1是取代的或未取代的三苯甲基，9-(苯基)咕吨基(以后称作“pixyl”)或四氢吡喃基(以后称作“THP”)。在一项更为优选的实施方案中，R1是一个未被取代的三苯甲基、一烷氧基三苯甲基、二烷氧基三苯甲基、三烷氧基三苯甲基、THP或9-苯基咕吨基。最好是，R1是4，4′-二甲氧基三苯甲基。各R2独立地是-H、-F、-NHR6、-CH2R6或-OR6。各R3独立地是-OCH2CH2CN，-SCH2CH2CN，取代或未被取代的脂族基团，取代或未被取代的芳族基团，或基团-OR7或-SR7。优选各R3独立地是-OCH2CH2CN、-SCH2CH2CN、4-氰基丁-2-烯硫基、4-氰基丁-2-烯氧基、烯丙基硫基、烯丙基氧基、2-丁烯硫基或2-丁烯氧基。R4和R5各自独立地为取代或未取代的脂族基团，取代或未取代的芳族基团，取代或未取代的芳烷基；或者R4和R5与它们所结合的氮原子一起形成一个杂环烷基或杂芳基，其中杂环烷基或杂芳基优选是5或6元环。优选R4和R5各为异丙基。R是-H，取代或未取代的脂族基团，取代或未取代的芳族基团，或是胺保护基。R6是-H，取代或未取代的脂族基团，取代或未取代的芳族基团，取代或未取代的芳烷基，或是一个保护基团，例如醇保护基，如叔丁基二甲基甲硅烷基，或是胺保护基。R7是取代或未取代的脂族基团，取代或未取代的芳族基团，取代或未取代的芳烷基，THP，4-甲氧基四氢吡喃基或2-氟苯基甲氧基哌啶-4-基。在一项具体的实施方案中，R7是邻氯苯基或对氯苯基。各B独立地是一个被保护或未被保护的核苷碱基，或者当存在一个或多个无碱基部分时，可以代表H。n是0或正整数。当本专利技术的三价磷多聚体被用来在固体载体上合成低聚核苷酸时，n优选是0至2。当在溶液中使用三价磷多聚体合成低聚核苷酸时，n优选是0至10。在某些实施方案中，R2代表一个C-烯丙基。最好是，R2代表H、O或OCH2CH2OMe。在一项实施方案中，该三价磷多聚体可以用结构式II或其立体异构物表示 在结构式II中，B和R2的定义与式I中相同。R8是一个取代或未被取代的三苯甲基，例如4，4′-二甲氧基三苯甲基。R10和R11独立地各为取代或未被取代的脂族基团。各R10和R11优选为异丙基。m是0或1。结构式I表示的三价磷多聚体可以用来制备结构式III表示的低聚核苷酸或其立体异构物 在结构式III中，X1、X2、X3、R2、R3和B的定义同结构式I。各X4独立地是＝O或＝S。R13是羟基保护基，硫羟基保护基，胺保护基，式-Y2-L-Y1基团，一种固体载体或基团-Y2-L-Y2-R15。Y1是可以与胺、硫羟基或羟基反应的官能基。优选Y1是酯基或羧酸基团。各Y2独立地是单键，-C(O)-，-C(O)NR17-，-C(O)O-，-NR17-或-O-。L是一个连接基团，优选是取代或未被取代的脂族基团，或是取代或未被取代的芳族基团。更优选的是，L是亚乙基。R17是-H，取代或未被取代的脂族基团，或是取代或未被取代的芳族基团。R15是适合固相低聚核苷酸合成的固相载体，例如孔可控的玻璃，聚苯乙烯，微孔聚酰胺，例如聚二甲基丙烯酰胺，聚乙二醇包覆的聚苯乙烯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亚磷酰胺化合物，其中含有由一个或多个核苷间磷原子连结的二个或多个核苷部分，该核苷间磷原子是磷（Ⅲ）原子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：N辛哈，
申请(专利权)人：艾夫西亚生物科技公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]