安卡拉病毒毒株FAdV‑HB及其灭活疫苗的制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种安卡拉病毒毒株FAdV‑HB及其灭活疫苗的制备和应用。从发病鸡场的肝脏组织样品中分离得到该毒株，经测序，进化分析和回归实验证明其为血清4型禽腺病毒，即心包积水肝炎综合征的病原。病毒经空斑纯化后在鸡肝癌细胞(LMH)细胞系增殖，保留高滴度毒价稳定的子代毒进行灭活苗的制备。动物实验证明，该灭活苗能对安卡拉病毒达到100％的保护率并且产生的抗体高，维持时间长，能有效预防安卡拉病，减少安卡拉病毒感染将给养殖业带来的巨大经济损失。

Ankara virus FAdV HB inactivated vaccine and its preparation and Application

Preparation and application of the invention discloses a Ankara virus strain FAdV HB and inactivated vaccine. The strain was isolated from the liver tissues of the diseased chicken farm, and sequenced as an etiological agent of the 4 avian influenza virus, namely, hepatitis B syndrome. The virus by plaque purification in chicken liver cancer cells (LMH) cell line proliferation, retain high titers price stability offspring poison inactivated vaccine preparation. The animal experiment showed that the antibody protection of the vaccine virus in Ankara reached 100% and the rate of production is high, the maintenance time is long, can effectively prevent the disease in Ankara, Ankara to reduce the huge economic loss caused by the virus infection.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物疫苗制备
，具体地指一种安卡拉病毒毒株FAdV-HB及其灭活疫苗的制备和应用。
技术介绍
禽腺病毒(Fowladenovirus)根据不同的群特异性抗原分为三个群:I群，II群和III群。I群禽腺病毒包括传统的禽腺病毒(Fowladenovirus，FAV)及其它禽类分离物，共12个血清型，代表株为鸡胚致死孤儿病毒(chickenembryolethalorphan,CELO)。Ⅱ群禽腺病毒包括火鸡出血性肠炎病毒(HEV)、雉鸡大理石脾病毒和鸡大脾病毒，它们与I群禽腺病毒无抗原相关性(Domermuthetal.,1980)。Ⅲ群禽腺病毒是与减蛋综合征(eggdropsyndrome,EDS)有关的一类病毒，可从鸡、鸡、鹅体内分离得到，致病性差异很大(RussellWC.,1995)，它们只是部分含有I群禽腺病毒的共同抗原(McFerranetal.,1978)。I群禽腺病毒呈现世界性分布，可感染多种禽类，在鸭鹅体内多呈隐性感染，但是对鸡的致病力较强。其所有12个血清型均能引起包涵体肝炎(IBH),只有血清4型禽腺病毒是心包积水肝炎综合征(HHS)的主要病原。很多研究表明，腺病毒相关病毒(adeno-associatedviruses,AAV)传染性法氏囊病毒和鸡传染性贫血病毒可有效增强I群禽腺病毒的致病性(Fadlyetal.,1976)。心包积水-肝炎综合征是由血清4型禽腺病毒(FAdV-4)引起的一种新型家禽疾病，其典型症状是导致3～5周龄肉鸡突然死亡，并伴有严重的心包积水和肝炎，因此而得名。又因本病1987年首次于报道于巴基斯坦安卡拉地区，故该病又被称为安卡拉病。随后本病逐渐蔓延至世界各地，给养禽业造成巨大的经济损失。FAdV-4具有明显的致病年龄段，对3-5周龄的致病力最强，即可通过水平传播也可通过垂直传播。其主要病变为心包腔积有清亮或淡黄色的水样或果冻状液体，肝脏有局灶性坏死出血。病理组织切片观察肝脏，肝细胞出现大量的嗜碱性核内包涵体。本病主要发生于3～5周龄的肉鸡、817麻鸡，偶见于20周龄肉种鸡和蛋鸡，其中以3～7周龄的鸡易发病。发病鸡群多于感染后3周龄开始死亡，4～5周龄达高峰，高峰持续期4～8d，5～6周龄死亡减少。病程8～15d，死亡率高达80％。发病鸡无明显先兆而突然倒地，沉郁，羽毛成束，出现呼吸道症状，两腿划空。鸡感染后可成为终身带毒者，并可间歇性排毒。自2014年江苏省第一次报到禽腺病毒的爆发，本病已在全国多地集中爆发，尤其是河南湖北和山东等地，对养禽产业造成巨大损失。通过对我国流行的Ⅰ群禽腺病毒进行血清型和基因型分析，发现我国主要流行A、B、C三种基因型，共6个血清型(火鸡1型、1型、4型、5型、8a/b型)。调查发现近期在豫南、皖北、苏北、鲁西北和胶东地区流行的禽腺病毒主要是血清4型和8a/b型，对鸡群的致死率较高，发病急，蔓延迅速，对我国的养禽业造成了巨大的威胁。因此，研制安全有效的I群禽腺病毒灭活疫苗，为提高国内I群禽腺病毒疫苗的防控能力和防止I群禽腺病毒蔓延具有重要的使用意义。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种安卡拉病毒毒株FAdV-HB及其灭活疫苗的制备和应用。该安卡拉病毒毒株FAdV-HB具有免疫原性好、增殖滴度高该制备方法将FAdV-HB毒株接种在鸡肝癌细胞(LMH)上，使病毒能在鸡肝癌细胞(LMH)上增殖，制备出能产生较高抗体的安卡拉病毒灭活疫苗。疫苗的生产工艺、安全性、保护效果、免疫程序和有效期实验研究表明该疫苗是安全有效的。为实现上述目的，本专利技术提供的一株安卡拉病毒毒株FAdV-HB，从湖北应城发病鸡场的肝脏组织样品中分离得到，经PCR扩增，连接T载体进行测序检测鉴定该病毒为安卡拉病毒。该毒株FAdV-HB命名为：I群禽腺病毒株FAdv-HB，该毒株于2017年1月3日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO：V201703。上述毒株FAdV-HB的形态特征：FAdV-HB属于I群禽腺病毒，呈球形，病毒颗粒直径70-90nm(电镜图)，无囊膜，其基因组为单分子的、线状、双股DNA，二十面体对称结构；DNA的分子量大小约45kb，占整个病毒粒子的11.3％～13.5％，其余部分为蛋白；病毒粒子具有252壳粒，其中二十面体的顶角壳粒为12个五邻体(penton)，每个五邻体有二条纤维突起，长度为100A-370A，这些纤突以五邻体为基底由衣壳表面伸出，纤突顶端形成头节区；五邻体和纤突的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用；此外，二十面体上还有240个非顶角壳粒，称为六邻体(Hexon)；六邻体是病毒粒子内最大的蛋白，是禽腺病毒的主要表面抗原蛋白，含有型、型间特异性抗原表位及中和性抗原表位；病毒含有约14条多肽，多肽II为hexon，III为五邻体；IIIa为五邻体周围蛋白；IV为纤维蛋白62K，V为核心蛋白；VI为六邻体相关蛋白；VII为核心蛋白II；VIII为五邻体相关蛋白；IX为9个六邻体组的特异性蛋白；TP为DNA的末端蛋白。利用上述安卡拉病毒毒株FAdV-HB制备灭活疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将上述毒株FAdV-HB接种鸡肝癌细胞上，培养，收获病毒液，2)经甲醛灭活后与矿物油佐剂混合乳化制成安卡拉灭活疫苗，用于预防安卡拉。本专利技术还提供了一种上述制备得到的灭活疫苗在预防安卡拉病中的应用。本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术提供FAdV-HB毒株，能在鸡肝癌细胞(LMH)上稳定增殖。由这个毒株制备的毒株FAdv-HB灭活疫苗能有效预防安卡拉病。2、本专利技术制备的疫苗稳定性好，试验证明具有良好的安全性，免疫保护效果达到100％。附图说明图1为本专利技术的总体技术流程图；图2为安卡拉病毒的电镜图；图3为凝胶电泳图；图中，1:阴性对照、M：2000PlusMaker、2:PCR产物；图4为安卡拉病毒接种LMH细胞的细胞病变情况图；图中，4A为正常细胞对照图，4B为接毒后细胞病变图图5为免疫鸡与未免疫对照鸡攻毒后剖解的病理变化图；图6为遗传进化分析图。具体实施方式为了更好地解释本专利技术，以下结合具体实施例进一步阐明本专利技术的主要内容，但本专利技术的内容不仅仅局限于以下实施例。实施例1安卡拉灭活疫苗的制备1、FAdV-HB毒株的分离鉴定自2013年以来，湖北，山东，河南多地肉鸡场爆发一种致死率高达80％的禽病，该病多对3-5周龄肉鸡致死，并且多数死鸡剖检呈现明显心包积水和肝炎症状。2015年，专利技术人在湖北麻城鸡场出现严重心包积水和肝炎的病死鸡的脏器中成功分离到本株毒。具体操作步骤如下：1.1病毒分离无菌采集病死鸡病变明显的脏器(心脏、肝脏)剪碎匀浆后，按1:4(v/v)的比例加入灭菌PBS，反复冻融3次后3000r/min离心30min，取上清加入青链霉素，使终浓度均为10000单位/ml，4℃过夜。用0.22μm的滤器过滤除菌，滤过液无菌检验合格后-80℃低温冰箱中保存备用。将上滤过液经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，0.2ml/胚，弃24h内死胚，取接种48h-168h内死亡鸡胚的尿囊液和胎儿，用上述方法处理后连续传3代，观察第3代死本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株安卡拉病毒毒株FAdV‑HB，该毒株FAdV‑HB命名为：I群禽腺病毒株FAdv‑HB，保藏编号为CCTCC NO:V201703。

【技术特征摘要】
1.一株安卡拉病毒毒株FAdV-HB，该毒株FAdV-HB命名为：I群禽腺病毒株FAdv-HB，保藏编号为CCTCCNO:V201703。2.根据权利要求1所述安卡拉病毒毒株FAdV-HB，其特征在于：所述毒株FAdV-HB的形态特征：FAdV-HB属于I群禽腺病毒，呈球形，病毒颗粒直径70-90nm无囊膜，其基因组为单分子的、线状、双股DNA，二十面体对称结构；DNA的分子量大小约45kb，占整个病毒粒子的11.3％～13.5％，其余部分为蛋白；病毒粒子具有252壳粒，其中二十面体的顶角壳粒为12个五邻体penton，每个五邻体有二条纤维突起，长度为100A-370A，这些纤突以五邻体为基底由衣壳表面伸出，纤突顶端形成头节区；五邻体和纤突的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重...

【专利技术属性】
技术研发人员：金梅林，马季，杨影，张丹，康超，李淑云，邹忠，林显，孙小美，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42