一组用于鸡源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针制造技术

本发明专利技术提供一组用于鸡源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：（1）、上游引物：5'‑TCCTCCACAAATCTAAACAACGAAC‑3'，下游引物：5'‑ATGATGAAGGGGTGTTCTACTGG‑3'，探针：5'‑TAACCTTCCGACCACTCTCCCAAAC‑3'，所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3；（2）、与（1）所述序列互补的序列。本发明专利技术的引物和探针可对牛羊猪肉和鸡精中的鸡源性含量进行定性、定量分析，对判断牛羊猪肉和鸡精中鸡源性含量具有重要意义，本发明专利技术将在食品检测领域发挥重要作用。

A set of specific primers and probes for real-time fluorescent PCR detection in chickens

The invention provides a group of chickens for real-time fluorescent PCR detection of specific primers and probes, nucleotide sequences of the specific primers and probes for (1) or (2) a: (1): 5', TCCTCCACAAATCTAAACAACGAAC upstream primer 3', primer: 5'ATGATGAAGGGGTGTTCTACTGG 3' probe: 5'TAACCTTCCGACCACTCTCCCAAAC, 3', target nucleotide sequences of the primers and probes into the amplified sequence of SEQ ID No.3; (2), and (1) the sequence of the complementary sequence. The primers and the probe of the invention can be analyzed qualitatively and the content of pork and chicken derived cattle chicken in quantitative, plays an important role in the judgment of pork and chicken in chicken flocks and herds of content, the invention will play an important role in the field of food detection.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品检测
，具体涉及一组用于鸡源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针。
技术介绍
随着经济的高速发展，人民的消费需求增长，我国肉类产量逐年增加，其中鸡肉产量占据肉类总产量的13.97%。与此同时，消费者对食品质量与安全性的要求也越来越高，其中掺杂使假不法行为是消费者长期关注的焦点之一。不法商贩、企业为获得非法利润，常以较低价的鸡肉冒充牛、羊、猪肉，严重侵害了消费者利益。这不仅涉及经济、营养价值和食品安全等问题，更直接影响消费者的健康，尤其是对某些食物过敏的消费者。自20世纪80年代鸡精调味品传入中国，鸡精作为调味料行业的后起之秀，发展速度相当惊人，已被普通家庭和餐饮业广泛使用。鸡精产品繁多纷杂，质量参差不齐，部分企业生产的鸡精主要是以淀粉、糊精、食盐、香精、色素等生产，其中一些甚至完全不含鸡的成分。“鸡精无鸡”问题侵犯了消费者的利益，也一直是消费者关心的问题。为维护广大消费者合法权益，稳定市场秩序，对动物性食品进行种源的鉴定显得十分必要。由于食品种类繁多、成分复杂、加工程度高等因素，使得常规检测方法如电泳、免疫学技术、光谱技术在种源的定性检测方面多有不足，如灵敏度低、周期长、费时费力。而实时荧光聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）技术以DNA为模板，设计特异引物探针，在封闭的体系中进行扩增和实时检测，无需电泳就可以对结果进行分析，避免了PCR产物的污染和溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）带来的危害，也缩短了检测时间；且扩增目的片段较短，尤其适用于加工食品。实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。在试验中使用了探针检测，随着PCR反应的进行，当合成的新链移动到探针结合位置时，Taq酶将探针切断，探针的完整性遭到破坏，荧光报告基团的荧光信号被释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，同时伴有一个荧光信号的释放。产物与荧光信号产生一对一的对应关系，随着产物的增加，荧光信号不断增强，从而对整个PCR反应过程进行实时和动态的监测分析。
技术实现思路
本专利技术目的在于设计一组鸡源性特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于牛羊猪肉和鸡精中鸡源性成分检测的快速、灵敏、特异性好的荧光定量PCR检测的方法。本专利技术采用基因克隆技术，将鸡源性DNA的cytb基因种内保守片段插入到载体pMD18-T中，获得含有cytb基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据鸡源性cytb的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。本专利技术旨在利用实时荧光PCR技术建立肉食品和鸡精中鸡源成分检测方法，为质检部门打击不法商贩的食品掺假、造假行为、维护消费者合法利益提供有力的技术参考。本专利技术的第一个目的是提供了一组用于鸡源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：（1）、上游引物：5'-TCCTCCACAAATCTAAACAACGAAC-3'下游引物：5'-ATGATGAAGGGGTGTTCTACTGG-3'探针：5'-TAACCTTCCGACCACTCTCCCAAAC-3'所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.3；（2）、与（1）所述序列互补的序列。作为优选，所述探针的5’端荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。本专利技术的第二个目的是提供鸡源性的PCR检测试剂盒，所述试剂盒为鸡源性的定性或定量检测试剂盒；所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针；作为优选，所述定量检测试剂盒还包括标准品，所述标准品的制备方法为：将鸡源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有鸡源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述鸡源性保守基因片段为序列表中SEQIDNo.2；作为进一步优选，所述鸡源性保守基因片段是以序列表中SEQIDNo.1的核苷酸序列为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得的：上游引物：5'-CGATTCTTCGCTTTACACTTC-3'下游引物：5'-TGATGATGAAGGGGTGTTCTA-3'；作为优选，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。本专利技术的第三个目的是提供上述特异性引物和探针在制备定性或定量检测鸡源性的试剂盒中的应用。作为优选，所述应用是分别以标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。作为优选，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。本专利技术的第四个目的是提供鸡源性的实时荧光定量PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，步骤如下：（1）制备标准品：将鸡源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有鸡源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述鸡源性保守基因片段为序列表中SEQIDNo.2；（2）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体系进行实时荧光PCR扩增；（3）标准曲线绘制；（4）通过标准曲线和待测样品的Ct值进行鸡源性的快速定量检测。作为优选，步骤（1）中所述鸡源性保守基因片段是通过以下引物扩增得到的：上游引物为5'-CGATTCTTCGCTTTACACTTC-3'；下游引物为5'-TGATGATGAAGGGGTGTTCTA-3'；作为优选，PCR扩增所述鸡源性保守基因片段的条件为：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min；作为优选，步骤（2）中所述引物和探针的用量均为1.6μl；作为优选，步骤（2）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。本专利技术的第五个目的是提供鸡源性的定性PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，步骤如下：（1）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品进行实时荧光PCR扩增；（2）通过待测样品的Ct值对鸡源性进行定性检测：当Ct值小于38时，为阳性；否则，为阴性；作为优选，步骤（1）中所述引物和探针的用量均为1.6μl；作为优选，步骤（1）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。本专利技术提供用于对鸡源性进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取待检测样品的DNA结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量或定性待测牛羊猪肉和鸡精中鸡源性含量的目的。本专利技术所提供的引物和探针可对牛羊猪肉和鸡精中的鸡源性含量进行定性、定量分析，对判断牛羊猪肉和鸡精中鸡源性含量具有重要意义，本专利技术将在食品检测领域发挥重要作用。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于鸡源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，其特征在于：所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：（1）、上游引物：5'‑ TCCTCCACAAATCTAAACAACGAAC ‑3'下游引物：5'‑ ATGATGAAGGGGTGTTCTACTGG ‑3'探针：5'‑ TAACCTTCCGACCACTCTCCCAAAC ‑3'所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3；（2）、与（1）所述序列互补的序列。

【技术特征摘要】
1.一组用于鸡源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，其特征在于：所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：（1）、上游引物：5'-TCCTCCACAAATCTAAACAACGAAC-3'下游引物：5'-ATGATGAAGGGGTGTTCTACTGG-3'探针：5'-TAACCTTCCGACCACTCTCCCAAAC-3'所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.3；（2）、与（1）所述序列互补的序列。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针的5’端荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。3.鸡源性的PCR检测试剂盒，所述试剂盒为鸡源性的定性或定量检测试剂盒；其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针；作为优选，所述定量检测试剂盒还包括标准品，所述标准品的制备方法为：将鸡源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有鸡源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述鸡源性保守基因片段为序列表中SEQIDNo.2；作为进一步优选，所述鸡源性保守基因片段是以序列表中SEQIDNo.1的核苷酸序列为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得的：上游引物：5'-CGATTCTTCGCTTTACACTTC-3'下游引物：5'-TGATGATGAAGGGGTGTTCTA-3'；作为优选，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。4.权利要求1或2所述的特异性引物和探针在制备定性或定量检测鸡源性的试剂盒中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用是分别以标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述实时荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，沈颂东，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32