一种木瑚菌属食用菌鉴别用分子标记及引物和探针制造技术

本发明专利技术涉及一种木瑚菌属食用菌鉴别用分子标记及引物和探针，所述木瑚菌属食用菌为木瑚菌属Lentaria patouillardii，其ITS特异性分子标记具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。针对所述分子标记设计特异性检测木瑚菌属Lentaria patouillardii的基因芯片，能在短时间内对木瑚菌属Lentaria patouillardii进行特异性鉴定，提高木瑚菌属Lentaria patouillardii鉴别的准确性和灵敏性，具有快速、准确、成本低的特点。

A wood Hu bacteria by using molecular markers and primers and probes for identification of edible fungi

The invention relates to a wooden coral genus with molecular markers and primers and probes for the identification of edible fungi, wood wood belongs to the genus of coral coral genus of Lentaria patouillardii edible fungi, the ITS specific molecular marker has the nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 shown. According to the gene chip Lentaria patouillardii molecular marker specific detection of wood coral genus, in a short period of time to the wood coral genus of Lentaria patouillardii specific identification, improve the wood coral genus of Lentaria patouillardii identification accuracy and sensitivity, and has the characteristics of fast, accurate and low cost.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物鉴别
，涉及一种真菌的鉴别方法，特别是涉及一种用于鉴别木瑚菌属真菌Lentariapatouillardii的ITS特异性分子标记，以及用于所述鉴别方法的专用引物、探针和基因芯片。
技术介绍
管涔山地处吕梁山系北端，平均海波1800～2000m，是温带大陆性季风气候和西伯利亚冬季冷气团交融门户，降雨量充沛，是山西三大河流的发源地，植物覆盖率高，植被分布呈现明显的垂直带谱。特殊的地理环境和气候环境造就了该地区独特的生物多样性，而来自管涔山脉的食用菌也因其独特的风味和营养价值，曾被纳为皇室贡品。因此，开展管涔山系食用菌分子标记研究，对于这一地区特有品种的开发与保护具有重要意义。木瑚菌属Lentariapatouillardii，属担子菌纲、多孔菌目、木须菌科、木瑚菌属(Lentaria)，是一种生长在管涔山一带的著名野生食用菌，我国发现有5种类，其中L.patouillardii为中国新记录种。传统的食用菌分类鉴定主要依据子实体的形态学特征，包括担孢子的大小和子实体真皮菌丝的形态特征。但子实体的许多形态学特征往往随生长条件的不同而发生变化，同时许多鉴别性特征又经常是几个种所共有，这就给传统的分类学带来了很大困难，仅仅依据形态学特征进行菌种鉴定不是十分可靠。随着分子生物学技术的快速发展，特别是分于标记和基因标记技术的建立与成熟，为发展简便、快速、准确的食用菌鉴定技术提供了有效手段。基因芯片是一种新型的DNA识别技术，利用芯片的高通量和特异性优势，可以在芯片上对相近亲缘关系的食用菌进行辨识，以提高检测的准确性。同时，基因芯片检测主要操作步骤依靠仪器设备完成，检测周期只需要6～8小时，不依赖传统检测中人的主观经验，可以在短时间内获得准确的检测鉴别结果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种木瑚菌属食用菌特异性ITS分子标记，以建立一种快速、灵敏、特异性好的木瑚菌属Lentariapatouillardii鉴别方法。提供用于所述木瑚菌属Lentariapatouillardii鉴别方法的引物和核酸探针，是本专利技术的另一专利技术目的。本专利技术采用基因克隆技术，并结合基因芯片技术，首先获得了木瑚菌属LentariapatouillardiiITSDNA片段中一段高度保守且特异性强的核酸序列，以作为特异性鉴别木瑚菌属Lentariapatouillardii的分子标记；进而依据该分子标记设计并合成了一组特异性引物和核酸探针，建立了特异性鉴别木瑚菌属Lentariapatouillardii的方法，并对所建立的方法进行了有效性评估试验。为实现上述专利技术目的，本专利技术所提供的木瑚菌属LentariapatouillardiiITS特异性分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述ITS特异性分子标记是使用通用引物ITS1/ITS4对从不同产地的木瑚菌属Lentariapatouillardii中提取的总DNA进行PCR扩增，PCR产物进行毛细管测序，测序结果在NCBI中进行全核酸数据库比对分析，确定出的能够作为基因芯片检测靶序列的特征序列。进而，本专利技术根据上述靶序列，依据引物与探针设计原则，设计了一对具有SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述核苷酸序列的、用于扩增所述ITS特异性分子标记的引物，以及一种具有SEQIDNO.4所述核苷酸序列的、用于检测所述ITS特异性分子标记的核酸探针。更具体地，本专利技术是在引物1的5'端标记有荧光报告基团Hex，并将所述核酸探针进行氨基化处理，即在核酸探针的5'端连接氨基，最终人工合成出具有下述核苷酸序列的引物和核酸探针。引物1：5'Hex-TTCCAGTTATGTTTCAGAAG-3'。引物2：5'-ACTCGCGGCGGACCAGCTGAT-3'。核酸探针：5'NH3-TTTTTTTTTTTTAAGTGTATATGGACAAAGGCGAGGGGCG-3'。本专利技术还提供了一种用于检测木瑚菌属Lentariapatouillardii的基因芯片。本专利技术所述的基因芯片采用本领域常规方法制备，并在所述基因芯片上固定有上述核酸探针。所述基因芯片采用的片基优选常规的醛基片基，以与所述氨基化的探针配合。本专利技术也提供了一种用于鉴别木瑚菌属Lentariapatouillardii的试剂盒，在所述试剂盒中至少包含有上述的木瑚菌属Lentariapatouillardii检测用基因芯片或核酸探针，用于扩增本专利技术所述木瑚菌属LentariapatouillardiiITS特异性分子标记的专用引物和PCR扩增试剂，以及其他必要的相关试剂。最后，本专利技术提供了一种鉴别木瑚菌属Lentariapatouillardii的方法，本专利技术所述方法是利用上述木瑚菌属LentariapatouillardiiITS特异性分子标记对待测木瑚菌属Lentariapatouillardii进行鉴定，利用PCR方法获得的木瑚菌属Lentariapatouillardii扩增产物中应包含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。具体地，本专利技术所述鉴别木瑚菌属Lentariapatouillardii的方法包括：a)提取木瑚菌属Lentariapatouillardii待测样本菌株或子实体的基因组总DNA；b)以所述引物对所述提取的总DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；c)将所述PCR扩增产物与所述核酸探针进行原位杂交，以特异性鉴定出木瑚菌属Lentariapatouillardii。本专利技术在PCR扩增产物与核酸探针原位杂交后，洗去未杂交的PCR扩增产物，对杂交结果进行检测。杂交结果为阳性，则所述待测样本为木瑚菌属Lentariapatouillardii；杂交结果为阴性，则所述待测样本不为木瑚菌属Lentariapatouillardii。本专利技术优选采用激光共聚焦扫描仪对上述杂交结果进行荧光扫描检测。本专利技术上述方法中，所述基因组总DNA提取、PCR扩增、原位杂交的方法也都是常规的。本专利技术较佳的PCR扩增程序如下：95℃预热5min；36个循环：95℃20s，58℃20s，72℃40s；最后72℃延伸5min。使用本专利技术提供的专用引物和核酸探针对同一地域生长的不同食用菌进行鉴定，结果显示只有木瑚菌属Lentariapatouillardii的PCR扩增产物与本专利技术核酸探针杂交结合并呈现阳性结果(检测位点亮)，其他食用菌的PCR扩增产物则与本专利技术核酸探针没有杂交结合(检测位点不亮)，说明本专利技术设计的引物能将木瑚菌属Lentariapatouillardii的特异性基因片段扩增出来，并与木瑚菌属Lentariapatouillardii核酸探针进行有效结合。同时，采用不同的核酸探针与木瑚菌属Lentariapatouillardii的PCR扩增产物进行杂交，也只有本专利技术的核酸探针具有阳性响应，其他核酸探针无响应，说明木瑚菌属Lentariapatouillardii核酸探针的特异性较好。以上结果证明本专利技术提供的检测方法特异性、准确性好。因此，本专利技术提供的木瑚菌属LentariapatouillardiiITS特异分子标记以及专用引物和核酸探针能够应用于木瑚菌属Lentariapatouillardii的快速鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种木瑚菌属食用菌ITS特异性分子标记，所述木瑚菌属食用菌为木瑚菌属Lentaria patouillardii，所述ITS特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种木瑚菌属食用菌ITS特异性分子标记，所述木瑚菌属食用菌为木瑚菌属Lentariapatouillardii，所述ITS特异性分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一对用于扩增权利要求1所述木瑚菌属食用菌ITS特异性分子标记的引物，具有SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述的核苷酸序列。3.一种用于检测权利要求1所述木瑚菌属食用菌ITS特异性分子标记的核酸探针，具有SEQIDNO.4所述的核苷酸序列。4.一种用于检测木瑚菌属Lentariapatouillardii的基因芯片，在所述基因芯片上固定有权利要求3所述的核酸探针。5.一种用于鉴别木瑚菌属Lentariapatouillardii的试剂盒，其中包含有权利要求3所述的核酸探针和权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭尚，周林，李瑶，
申请(专利权)人：山西省农业科学院食用菌研究所，
类型：发明
国别省市：山西;14