本发明专利技术属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种甲型流感病毒重组蛋白，该重组蛋白主要包含甲型流感病毒核蛋白两个优势抗原表位。为提高该重组蛋白在原核表达系统中的产量，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，通过化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体。本发明专利技术还涉及该重组蛋白单克隆抗体的制备，经过抗原免疫、细胞融合及多轮筛选后得到单克隆细胞株，纯化单克隆抗体并分别标记胶体金颗粒，通过正交实验确定最佳单抗配对组合，可用于甲型流感病毒诊断。
Preparation of a recombinant protein of influenza A virus and its monoclonal antibody
The invention belongs to the technical field of biology. The invention provides a recombinant protein of influenza A virus, which mainly comprises two dominant antigenic epitopes of influenza A virus nucleoprotein. In order to improve the recombinant protein in the prokaryotic expression system of production, by the preferred codons of E.coli to convert the recombinant protein amino acid sequence of nucleotide sequence corresponding to the through chemical synthesis of the nucleotide sequence and construct the recombinant expression vector. The invention also relates to the preparation of monoclonal antibodies against the recombinant protein, after antigen immunization, cell fusion and multiple rounds of screening by hybridoma, purification of monoclonal antibody and colloidal gold particles were labeled by orthogonal experiment, determine the optimal antibody pairs can be used for diagnosis of influenza virus.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种甲型流感病毒重组蛋白、编码该重组蛋白的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的质粒载体、转化含有上述质粒载体的菌株，还涉及使用上述的重组蛋白制备甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体，并应用于甲型流感病毒早期诊断。
技术介绍
流行性感冒(流感)多数是由甲型流感病毒引起的急性呼吸道感染，其传染性强、传播速度快，严重危害人类生命健康。这些年来，该疾病发病率逐年上升，但治疗效果却不甚理想，其中一个关键原因是无法实现甲型流感病毒早期快速诊断以争取治疗时间，从而导致患者病情恶化甚至死亡。因此，能够在流感早期做出正确诊断显得尤为重要。目前，国内外对于甲型流感病毒诊断有如下几种方法：1.病毒分离培养从呼吸道标本(咽拭子、鼻拭子、痰)中分离并培养流感病毒，准确率高、假阳性低。但这种检测方法需要专业设备，对操作人员要求高，检测时间长，不适合大量样本快速诊断。2.病毒核酸检测RT-PCR法检测甲型流感病毒核酸，该方法特异性和敏感性好，能快速区分病毒亚型，适合大量样本同时检测，但是设备昂贵，对操作人员要求高，检测时间较长，并且检测费用高。3.免疫学诊断通过免疫学方法，具体采用单克隆抗体识别检测呼吸道标本中的甲型流感病毒抗原，该方法特异性及灵敏度俱佳。若结合胶体金平台，一般能在10～15分钟内获得准确结果，适合大批量样本快速检测，无特殊设备及人员要求。目前，免疫学方法检测甲型流感病毒由于操作简便、结果易于判定，已成为主流方向。该方法通常需要制备可识别不同亚型甲型流感病毒单克隆抗体，工作量极大，因此，相对保守的甲型流感病毒核蛋白成为单克隆抗体制备及识别靶标。但常规甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体制备所使用的免疫原是基因工程技术表达的完整蛋白，由于碱基密码子的缘故，该蛋白在大肠杆菌中表达困难、表达量极低，导致后续纯化工作难以开展，严重阻碍其单克隆抗体制备。另外，由于抗原表位氨基酸序列同源性缘故，使用流感病毒全长序列作为免疫原制备得到的单克隆抗体特异性差，与其它物种蛋白具有高度同源性，从而导致检测结果失真。
技术实现思路
设计目的：解决免疫学方法检测甲型流感病毒的不足之处，通过设计、表达甲型流感病毒重组蛋白并制备其单克隆抗体，从而实现甲型流感病毒特异性检测识别，既增强了检测灵敏度兼顾其广谱性，又不会导致检测结果失真。设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以甲型流感病毒核蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原两个优势抗原表位，序列比较结果显示所选择的两个抗原表位是所有亚型的甲型流感病毒核蛋白共有表位并与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为增强免疫效果并缩短单克隆抗体制备时间，将所选择的两个优势抗原表位序列分别重复后通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接，形成甲型流感病毒重组蛋白氨基酸序列。(3)为提高甲型流感病毒重组蛋白表达量，采用大肠杆菌偏爱密码子，将甲型流感病毒重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET-28a(+),构建甲型流感病毒重组蛋白表达载体。(5)甲型流感病毒重组蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选得到甲型流感病毒重组蛋白表达菌株。(6)甲型流感病毒重组蛋白表达菌株大规模培养后，经超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化甲型流感病毒重组蛋白。(7)纯化的甲型流感病毒重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮亚克隆筛选最终得到分泌甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(8)将杂交瘤细胞株分别制备Balb/c小鼠腹水，使用ProteinA亲和层析法纯化单克隆抗体，并分别标记胶体金颗粒。(9)正交实验筛选显示4C10单抗包被与3D7单抗标记配对为最佳检测甲型流感病毒组合。设计方案1：一种甲型流感病毒重组蛋白，该重组蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQIDNo:1所示的氨基酸序列。设计方案2：一种甲型流感病毒重组蛋白，该重组蛋白质的氨基酸序列包含如序列表SEQIDNo:2和SEQIDNo:3所示氨基酸序列。设计方案3：一种核苷酸序列，该核苷酸序列如序列表SEQIDNo:4所示，可编码权利1-2所述的甲型流感病毒重组蛋白。设计方案4：一种质粒载体，该质粒载体含有权利要求3所述的核苷酸序列。设计方案5：一种菌株，该菌株包含采用权利要求4所述的质粒载体。本专利技术与
技术介绍
相比，一是采用大肠杆菌偏爱密码子优化甲型流感病毒重组蛋白对应的核苷酸序列，从而大大提高了甲型流感病毒重组蛋白在大肠杆菌中的表达水平；二是作为免疫原的甲型流感病毒重组蛋白仅含有甲型流感病毒特有的优势抗原表位，保证了最终得到的单克隆抗体仅特异性识别甲型流感病毒核蛋白，并筛选得到了最优单抗配对组合，提高了检测灵敏度；三是免疫原含有的优势抗原表位是不同亚型甲型流感病毒核蛋白的共有抗原表位，保证了检测广谱性，避免漏检。具体实施方式以下实施例虽然对本专利技术的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本专利技术设计思路的简单文字描述，而不是对本专利技术设计思路的限制，任何不超出本专利技术设计思路的组合、增加或修改，均落入到本专利技术的保护范围内。实施例1：甲型流感病毒核蛋白优势抗原表位选择以甲型流感病毒核蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择A优势抗原表位(SEQIDNo:2)和B优势抗原表位(SEQIDNo:3)。同时，序列比较结果显示所选择的A、B两个优势抗原表位序列具备广谱性，是所有甲型流感病毒核蛋白共有表位；并且A、B表位与其它蛋白序列无明显同源性，仅存在于甲型流感病毒核蛋白序列。实施例2：甲型流感病毒核蛋白优势抗原表位的串联为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的激活效果以缩短单克隆抗体制备时间，将甲型流感病毒核蛋白A、B两个优势抗原表位序列分别重复后再通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接,得到重组蛋白氨基酸序列，其具体序列如序列表SEQIDNo:1所示。实施例3：优化编码甲型流感病毒重组蛋白的核苷酸序列在甲型流感病毒重组蛋白氨基酸序列不变的前提下,为了提高甲型流感病毒重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码甲型流感病毒重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，具体序列如序列表SEQIDNo:4所示，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列后，由杭州贤至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因连接于pMD20-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。实施例4：构建甲型流感病毒重组蛋白表达载体将含目的基因的pMD20-T载体和PET-28a(+)载体(德国Novagen公司)通过限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)分别于37℃双酶切12小时，酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和PET-28a(+)载体(本专利技术所使用的胶回收试剂盒均来自宁波中鼎生物技术有限公司)。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和PET-28a(+)载体按一定的比例于4℃连接12小时后，连接产物转化DH5α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甲型流感病毒重组蛋白，其特征在于该重组蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种甲型流感病毒重组蛋白，其特征在于该重组蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQIDNo:1所示的氨基酸序列。2.一种甲型流感病毒重组蛋白，其特征在于该重组蛋白质的氨基酸序列包含如序列表SEQIDNo:2和SEQIDNo:3所示氨基酸序列。3.一种核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列如序列表SEQIDNo:4所示，可编码权利1-2所述的甲型流感病毒重组蛋白。4.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求3所述的核苷酸序列。5.一种菌株，其特征在于该菌株包含采用权利要求4所述的质粒载体。6.权利要求1-2所述的甲型流感病毒重...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡祥叶，余铭恩，项美华，朱伟，王璐，刘清泉，吴琼杉，
申请(专利权)人：杭州贤至生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。