一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂及其应用。本发明专利技术的饲料添加剂含有表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌，所述的表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌是通过将含有SEQ ID NO.1所示的牛乳铁蛋白肽基因的载体导入乳酸乳球菌MG1363中得到的。实验证明，本发明专利技术的饲料添加剂可提高雏鸡日增重，降低料重比，具有促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的作用。而且相较于传统抗生素，安全、绿色、无污染、无残留，且能提高肠内有益菌的数量菌，调节肠道内菌群平衡。因此，本发明专利技术的提出为以乳酸菌为载体的抗菌肽在饲料添加剂中的应用、开发和工业化生产等方面提供了新的技术手段和理论支持。

For promoting chicken growth and enhance the resistance of chicken feed additive and application ability of Pullorosis Salmonella infection

The invention discloses a method for promoting chicken growth and enhance the resistance of chicken feed additive and application ability of Pullorosis Salmonella infection. The feed additive of the invention contains recombinant Lactococcus lactis expressing bovine lactoferrin peptide, recombinant Lactococcus lactis the expression of bovine lactoferricin is bovine lactoferricin gene by SEQ containing ID represented by NO.1 vector into Lactococcus lactis MG1363. The experiment proved that the feed additive of the invention can increase the weight gain of chicks, decrease the ratio of feed, can promote the growth and enhance the role of the resistance of chicken Pullorosis Salmonella infected chickens ability. But compared with traditional antibiotics, safe, green, no pollution, no residue, and can improve the intestinal bacteria quantity, regulating intestinal flora balance. Therefore, the present invention provides a new technical means and theoretical support for the application, development and industrial production of the antibacterial peptide with the lactic acid bacteria as carrier.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种饲料添加剂及其应用，特别涉及一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂及其应用，属于饲料研究

技术介绍
鸡白痢沙门氏菌病是由鸡白痢沙门氏菌引起的一种死亡率高，影响范围广的传染病，在自然情况下，很多品种的鸡均易感，尤其以1～2周龄以内的雏鸡发病率与病死率最高，严重危害家禽业。病鸡常出现采食量减少，瞌睡，惧冷，易靠近热源，不喜欢活动，萎靡不振等症状；同时排出白色粪便，严重的会出现肛门周围粘有粪便的糊肛情况。在正常情况下，鸡白痢沙门氏菌的宿主主要是鸡，不过也有报道显示火鸡、鹌鹑、雉鸡、麻雀等动物能够感染鸡白痢沙门氏菌。鸡白痢可能通过死亡率高，发病率高和产蛋量减少造成全球经济损失。由鸡白痢沙门氏菌引起的疾病，不仅给家禽生产繁殖造成影响，同时也是人类食源性疾病的主要病原菌，因此防治和解决沙门氏菌污染迫在眉睫。目前，通过接种疫苗，使用抗生素和其他药物是预防鸡白痢沙门氏菌病的主要措施，但抗生素会造成病原体的耐药性和在禽类产品抗生素残留等安全性问题。而抗菌肽和益生乳酸菌作为微生态饲料添加剂已经广泛应用于饲料加工业，因其具有安全、绿色、无污染、无残留等化学特性备受人们的关注，研究与使用抗菌肽替代抗生素是养殖业生产中的发展趋势。乳铁蛋白肽(Lfcin)是乳铁蛋白在酸性环境条件下，经胃蛋白酶作用，释放出来的一段小分子抗菌肽，具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫、消炎、促生长及参与免疫反应等功能。由于牛乳铁蛋白肽具有普通抗生素具有的广谱抗菌能力和抗生素所不具有的不易产生耐药性优点，还能够抑制病毒、真菌增殖和抑制肿瘤细胞生长，对真核细胞却几乎没有毒性，在目前研究范围内，是一种健康、安全、绿色的抗菌肽，并对于应用在养殖业方面，具有广泛的使用前景和巨大的市场开发潜力。本专利技术专利技术人在前期工作中成功构建了能够表达牛乳铁蛋白肽的乳酸乳球菌重组菌株pAMJ399-LFBA/MG1363，该重组菌既有乳酸菌的益生性，又具有牛乳铁蛋白肽的生物学功能，为研究替代饲料中抗生素的可行性，将重组菌株pAMJ399-LFBA/MG1363添加到饲料中对雏鸡进行饲喂，从雏鸡的生长性能、肠道菌群的变化以及抗鸡白痢沙门氏菌感染的保护作用等方面综合分析，以探索表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌在家禽业中的应用前景。本专利技术的提出为以乳酸菌为载体的抗菌肽在饲料添加剂应用、开发和工业化生产等方面提供了新的技术手段和理论支持。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂及其用途。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术以牛乳铁蛋白上的17-41位(LFcin)和268-284位(LFampin)氨基酸为参考序列，优化设计这两段基因，成功构建了表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363。该重组系统既具有乳酸乳球菌益生性、安全性，还具有牛乳铁蛋白肽的抗菌、抗病毒等生物学特性；该重组菌还可以通过先天性免疫激活肠道黏膜免疫系统，却不刺激机体产生抗体。为检测表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌对雏鸡生长的影响，将1日龄雏鸡随机分成4组，每组8只，实验组饲喂含有2×1013cfu/kgpAMJ399-LFBA/MG1363重组乳酸乳球菌的饲料，同时以饲喂含有pAMJ399/MG1363饲料的空载体组、饲喂含有GM17培养基饲料的组和饲喂含有抗生素的组作为对照，连续饲喂14d，测定雏鸡体重变化及饲料重量；心脏采血处死雏鸡测定免疫器官胸腺、脾和法氏囊的指数；同时收集回肠和盲肠的肠黏液，用菌落计数的方法比较各组肠道菌群差异。结果表明饲喂pAMJ399-LFBA/MG1363重组乳酸乳球菌组与培养基和空载体对照组相比，雏鸡的日增重显著增加，料重比显著降低，提高了饲料的转化率。饲料中添加pAMJ399-LFBA/MG1363组与培养基组相比，胸腺指数、脾指数和法氏囊指数均有所增加且差异极显著(P＜0.01)。回肠和盲肠肠道菌群测定结果可见，pAMJ399-LFBA/MG1363组降低了大肠杆菌、链球菌的数量，提高了乳酸杆菌和双歧杆菌的含量。以上结果表明，表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌能够促进雏鸡生长，改善肠道菌群和提高机体免疫。为进一步检测重组乳酸乳球菌的抗菌活性，本专利技术对其抗鸡白痢沙门氏菌感染的保护作用进行研究。将1日龄雏鸡随机分成4组，每组15只，实验组饲喂含有2×1013cfu/kgpAMJ399-LFBA/MG1363重组乳酸乳球菌的饲料，同时以饲喂含有pAMJ399/MG1363饲料的空载体组、饲喂含有GM17培养基饲料的组和饲喂含有抗生素的组作为对照，连续饲喂14d，第7d时给雏鸡灌服鸡白痢沙门氏菌1mL(3.16×1012cfu/mL)，连续观察7天，并记录临床症状和发病情况；分别于攻菌前0h和攻菌后的1d、3d、5d和7d心脏采血处死雏鸡，采集血清及盲肠黏液，通过试剂盒检测血清中总IgG和盲肠黏液中总SIgA的水平；取雏鸡盲肠扁桃体，研磨后提取RNA，qRT-PCR测定非特异免疫信号通路的TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6的转录水平；攻菌后的第7d采集各组雏鸡的心脏、肝脏、脾脏及十二指肠，HE染色观察各组织器官病变情况。结果表明饲料中添加pAMJ399-LFBA/MG1363能提高血清总IgG和黏液中总SIgA免疫球蛋白水平，增强其免疫力；其中攻菌后5d和7d雏鸡血清中IgG的含量显著升高，与培养基组相比差异极显著(P＜0.01)，攻菌7d后雏鸡黏液中SIgA的含量高于培养基组，且差异极显著(P＜0.01)，与抗生素组无明显差异。对各组织器官进行HE染色后，pAMJ399-LFBA/MG1363组和抗生素组心脏、肝脏、脾脏及十二指肠病变情况明显轻于培养基组和空载体组。对非特异免疫信号通路的TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6的转录水平测定结果表明，pAMJ399-LFBA/MG1363组雏鸡感染3d时，TLR4、MyD88mRNA相对水平显著升高；7d时有所下降，其中pAMJ399-LFBA/MG1363组TLR4mRNA相对水平高于培养基组，差异极显著(P＜0.01)，MyD88mRNA相对水平高于培养基组，差异显著(P＜0.05)；感染7d时，pAMJ399-LFBA/MG1363组与培养基组相比，TNF-α、NF-κB、IL-8mRNA相对水平高，TNF-αmRNA转录水平差异极显著(P＜0.01)，NF-κB、IL-8mRNA相对水平差异性显著(P＜0.05)，IL-6mRNA相对水平差异不显著(P＞0.05)；本研究表明，雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌后，表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌能够缓解各器官病变，提高血清和黏液中免疫球蛋白水平，激活先天免疫系统及信号通路，在抗鸡白痢沙门氏菌感染的过程中起到了保护作用。以上结果表明表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌作为抗生素的替代品应用于饲料添加剂中具有潜在的应用前景，能够起到促进雏鸡生长、抗鸡白痢沙门氏菌感染的保护作用。因此，在上述研究的基础上，本专利技术提出了一种促进雏鸡生长及增强雏本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂，其特征在于含有表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌，所述的表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌是通过将含有SEQ ID NO.1所示的牛乳铁蛋白肽基因的载体导入乳酸乳球菌MG1363中得到的。

【技术特征摘要】
1.一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂，其特征在于含有表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌，所述的表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌是通过将含有SEQIDNO.1所示的牛乳铁蛋白肽基因的载体导入乳酸乳球菌MG1363中得到的。2.如权利要求1所述的添加剂，其特征在于所述的载体为乳酸乳球菌表达载体质粒pAMJ399。3.如权利要求1所述的添加剂，其特征在于所述的表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌是通过以下方法构建得到的：(1)根据乳酸乳球菌MG1363密码子偏嗜性，通过密码子优化设计并合成两段牛乳铁蛋白肽LFcin和LFampin的基因序列，然后通过在两段基因间添加信号肽和RBS序列，...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐丽杰，李一经，徐义刚，乔薪瑗，王丽，姜艳平，崔文，邵怡岚，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23