本发明专利技术涉及一种修饰的ＣｐＧ寡聚脱氧核苷酸（ＯＤＮ），其由连续的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（ｄＴ）序列偶联到具有免疫调节功能的ＣｐＧ ＯＤＮ的３′－末端而制备出来，用以增强脾细胞、巨噬细胞和外周单核细胞的免疫活性，因此，能有效地用作预防和治疗乙型肝炎的疫苗佐剂，或用作抗癌剂。由于在其３′－末端具有连续ｄＴ序列的硫代磷酸酯ＣｐＧ ＯＤＮ显示出诱导Ｔｈ－１免疫应答的高度活性并且不产生体内毒性，从而保证了它的安全性，能够有效地用作疫苗佐剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具有改善的免疫调节功能的经修饰的CpG寡聚脱氧核苷酸(ODN)。特别地，本专利技术涉及修饰的CpG ODN，它是由连续的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷(dT)序列偶联到具有免疫调节功能的CpG ODN的3′-末端而制备出来的，它能导致脾细胞、巨噬细胞和外周单核细胞改善的免疫活性，因此，能被有效地用作预防和治疗乙型肝炎疫苗的佐剂，或用作抗癌剂。
技术介绍
脊椎动物能够抑制其基因组DNA序列中CpG二核苷酸的表达，或使表达的CpG二核苷酸的胞嘧啶残基甲基化(Krieg，Ann.Rev.Immunol.，2002，20，709；McClelland&Ivarie，Nucleic Acids Res.1982，23，78)。与此同时，微生物的CpG二核苷酸能以正常的速率被表达并且不被甲基化，因此利用脊椎动物和微生物之间表达CpG二核苷酸水平的差异就能检测脊椎动物中的微生物感染。通过Toll样受体9(TLR9)，一种模式识别受体，微生物基因组DNA可以被树突细胞或表达TLR9的B细胞所识别，并且最终激活宿主细胞的先天免疫系统。先天免疫系统被赋予了去除癌细胞的机制，以及抗微生物或寄生虫感染的自我防御机制，因此通过适当修饰CpG ODN，有望开发出能诱免疫系统抗癌活性的抑癌免疫佐剂。利用CpG ODN活化免疫系统的研究在过去几十年中已经取得了积极的进展。参照CpG二核苷酸为中心，CpG ODN在5′和3′末端都含有至少四个碱基，CpG ODN的免疫活性由其碱基序列表征。CpG ODN可被划分为2个组，K型和D型。K型CpG ODN刺激脊髓系细胞和B细胞从而导致它们增殖或分泌免疫球蛋白M或IL-6(Klinman等，Microbes Infect.，2002，897-901)。另一方面，D型CpG ODN活化单核细胞使之分化成树突细胞或者刺激天然杀伤细胞分泌IL-6(Klinman等，Eur.J.Immunol.，2002，32，2617-22；Gursel等，J.Leukoc.Biol.，71，813-20，2002)。另外，D型CpG ODN活化B220+树突细胞以产生IFN-α，而TLR9+B220+树突细胞释放IL-12以应答D型CpG ODN。这些结果表明有几个途径可以通过刺激特定免疫细胞增强CpG ODN的免疫活性(Hemmi等，J Immunol.，2003，170，3059-3064；Kerkman等，J.Immunol.，2003，170，4465-4474)。已经有各种类型的CpG ODN被设计出来以改变病理状态，如感染，自身免疫疾病和癌症。其中，开发抗癌免疫治疗性CpG ODN的策略可以依赖于主要由CpGODN刺激的效应细胞。为了利用CpG ODN增加细胞介导的免疫性，以下两个方法被普遍使用。第一个方法是通过活化天然或专门的树突细胞从而增加局部或系统免疫性。癌细胞下调其抗原递呈能力以逃避宿主细胞的免疫监视系统，而使宿主的细胞毒性T细胞不能识别它们从而能够在宿主细胞中存活下来。为解决该问题，已经开发出了一种方法，即用癌抗原中的强免疫原性肽和CpG ODN免疫佐剂一起免疫宿主。通过该方法，有着高抗原递呈活性的树突细胞能够吸收癌抗原肽，并且在被CpG ODN活化时导致活化细胞毒性T细胞。然后活化的细胞毒性T细胞能够有效地消灭癌细胞。有报道说，该方法能够杀死来自小鼠的RMA(Stern等，J.Immunol.，2002，168，6099-6105)。IFN-γ在这些免疫应答中起着重要的作用。尽管这不是通过树突细胞活化实现的，但其仍能够以与树突细胞通过呈递CpGODN 2006直接作用于B细胞同样的机理，激活抗癌免疫性并且增加能诱导B和T细胞相互作用的共刺激因子的表达(Jahrsdorfer等，J.Leukoc.Biol.，2001，69，81-88)。另一个方法是通过活化天然杀伤细胞来增加先天免疫性。通过从外界引入癌抗原活化树突细胞可能会激活细胞毒性T细胞，但必须是在MHC I类分子表面存在癌抗原，从而在细胞毒性T细胞中产生细胞毒性。可是，在许多情况下，在癌细胞表面存在的癌抗原太少以至于不能从细胞毒性T细胞中产生细胞毒性，因此通过活化树突细胞来消除癌细胞的方法经常无效。为了克服这种局限，有人建议激活无论在癌细胞表面是否有癌抗原都能表现细胞毒性的天然杀伤细胞。另外，活化的天然杀伤细胞激活单核细胞或巨噬细胞，导致不依赖抗原的抗癌免疫系统的活化。据报道，在使用以上方法的小鼠肿瘤模型中，CpG ODN 1584给药可体内阻止NK敏感性B16.F1黑素瘤的转移，而注射CpG ODN 1826可在体内有效防止NK抗性的EL4淋巴瘤(Ballas等，J.Immunol.，2001，167，4878-4886)。另外，诱导出BALB/C小鼠中的C26结肠癌肿块后，直接把ODN 1826注射进发生肿瘤的损伤处，可显著缩减肿瘤的大小。该数据显示近肿瘤的CpG ODN单独治疗可产生强烈的CD8 T细胞应答和先天效应机制，似乎共同作用可以克服免疫系统对生长中的肿瘤的非应答性。(Heckelsmiller等，J.Immunol.，2002，169，3892-3899)。相反的，用CpG ODN单独治疗的方法难以在体内消除鼠38C13 B细胞淋巴瘤。可是，假如用CpG ODN处理38C13淋巴瘤抗原特异性单克隆抗体，活化的天然杀伤细胞能够通过运用抗体依赖的细胞毒性来高效地清除38C13淋巴瘤(Woodridge等，Blood，1997，89，2994-2998)。与此同时，抗原或其等价物和CpG ODN作为免疫刺激剂一起使用能够诱导出抗癌的体液免疫。Tras tuzumab和rituximab是已知商品化的对HER-2蛋白特异性的单克隆抗体，HER-2蛋白分别过量表达于癌细胞和非Hodgkins B细胞淋巴瘤。最近，用CpG ODN加肿瘤抗原特异性抗体的联合治疗在临床前期证实了有效的肿瘤抗性，而且现在正进入临床试验期。(Jahrsdorfer等，Sem.Oncol.，2003，30.476-482)。由于核苷酸序列在5’和3’末端处含CpG二核苷酸，CpG ODN具有强先天免疫活性。但由于CpG ODN本身是野生型的结构，与体内DNA分子的结构没有区别，它并不显示出任何细胞毒性。然而，CpG ODN中有一个缺陷，即由于其野生型结构，它在体内易于降解，从而导致免疫活性的半衰期降低。尽管增加每天CpGODN的剂量有可能克服这一缺陷，但是并不经济。据报道，在合成CpG ODN时，将作为DNA分子骨架的磷酸二酯键改变为硫代磷酸酯键，CpG ODN的免疫活性增大10至100倍(Sester等，J.Immnol.，2000，165，4165-4173)。可是，该方法带来的问题是由于骨架的改变导致对免疫细胞细胞毒性效果的改变以及CpG免疫活性的改变。因此，对于CpG ODN结构修饰来说，还不清楚该方法是否是最优化的。CpG ODN显示出物种特异性，且相比于实验动物，还没有报道CpG ODN在人类中显示出更高的免疫活性。另外，由于CpG ODN的作用机制仍未知，因此很难针对人免疫细胞开发出有效的免疫治疗性CpG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种显示出免疫活性并具有ＣｐＧ基序的硫代磷酸酯或磷酸二酯或结构修饰的寡聚脱氧核苷酸（ＯＤＮ），其特征在于在ＯＤＮ的３′－末端偶联连续的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（ｄＴ）序列。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：金寿起，朴升圭，朴守贞，曹铉哲，
申请(专利权)人：延世大学校，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]
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