原多甲藻的培养基与培养方法技术

本发明专利技术公开了一种原多甲藻培养基和培养方法，培养基包括下列重量的组分：NH4NO3，20‑100mg；CO(NH2)2(尿素)，20‑60mg；KH2PO4，1‑10mg；NaHCO3，100‑800mg；MnCl2·4H2O 15‑50g；FeC6H5O7·5H2O(柠檬酸铁)，10‑30mg；VB12，1×10‑5‑1×10‑3mg；VB1，50‑200mg；KCl，0.5‑5mg；Na2EDTA 10‑15g；壳寡糖0.2‑5g（分子量1500‑2000Da）海水1000mL。原多甲藻培养基的培养方法，包括如下步骤：第一阶段：三角烧瓶培养；第二阶段：矿泉水桶培养。本发明专利技术给出了原多甲藻培养的最适营养盐配方，可提高原多甲藻毒素产量并降低养殖成本。且采用矿泉水桶培养原多甲藻与传统的露天开放水泥池式扩大培养相比，成本低，不易污染，易于操作，大大降低了工作量，使原多甲藻生长速度大幅度提高，培养周期缩短。

Culture medium and culture method of primary dinoflagellate

The invention discloses a primary dinoflagellate culture medium and culture method, culture medium comprises the following components: NH4NO3, weight 20 100mg; CO (NH2) 2 (urea), 20 KH2PO4, 1 60mg; 10mg; NaHCO3100 800mg; MnCl2 4H2O 15 50g; FeC6H5O7 5H2O (ferric citrate), 10 30mg; VB12, 1 x 10 5 1 x 10 3mg; VB1, 50 KCl, 0.5 200mg; 5mg; Na2EDTA 10 15g; 0.2 5g chitosan (molecular weight 1500 2000Da) seawater 1000mL. The invention relates to a method for culturing the original dinoflagellate culture medium, which comprises the following steps: the first stage: the triangular flask culture; the second stage: the cultivation of the mineral water bucket. The present invention provides the optimum nutrient formula for the cultivation of the original dinoflagellate, which can increase the output of the original polysaccharide and reduce the breeding cost. And the use of mineral water bucket culture open open pool type cement raw Peridiniaceae and traditional culture expansion compared to low cost, easy pollution, easy operation, greatly reducing the workload, the dinoflagellate growth rate increased greatly, shorten the period of training.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种原多甲藻培养基配方及采用矿泉水桶充当容器的养殖方法。属于海洋微藻养殖领域。
技术介绍
贝类毒素因其强毒性和不可预见性等特点，对消费者健康安全和近海生态安全存在严重威胁，是近年来国际社会较为关注的生态灾害和重大海洋环境问题。氮杂螺环酸毒素（Azaspiracid，AZA）是现有的八大类贝类毒素中发现最晚但毒性最强的一类新型脂溶性贝类毒素，因其毒性强、残留高且代谢慢，成为欧盟、美国、加拿大等国家重点关注的对象，不仅将其限量标准设定为160µgAZA-1eq/kg（AZA1-3），数值普遍低于其他贝类毒素，且在国际贸易中重点加以监控。因此，原多甲藻酸贝类毒素的检测工作，已成为出口贸易和保障消费者安全必要保证。目前国际上标准物质制备方法多是将阳性贝类样品经过萃取纯化后制备而成的，存在的主要问题是样品来源不稳定，批次间存在较大差异；且所需阳性贝类样品量大，运输及提取加工前处理复杂。而以产毒藻为来源的毒素标准品制备，不仅能保障这一毒素的稳定来源，而且由于基质干扰少，是目前最好的标准品制备原料。本申请人于2016年4月8日申请保藏一种氮杂螺环酸毒素的产毒原多甲藻，保藏于中国典型微生物保藏中心，分类命名为：AzadiniumpoporumAZDY06，生物保藏号为CCTCCNO：M2016181。具有优良的产毒性状，已初步开发出毒素的提取纯化过程。而目前产毒藻的连续扩大培养、营养液循环与补充以及高浓度产毒藻的收集，成为这一技术的主要制约瓶颈。目前，采用传统f/2培养基进行原多甲藻培养，藻细胞生长缓慢、细胞密度低、单细胞产毒能力弱（40fg/cellAZA2）、扩大培养时易污染且离心收集耗时。因此，急需开发产毒原多甲藻的扩大培养与毒素制备原料高效收集方法。传统藻细胞扩大培养的方法是露天开放水泥池式培养，藻细胞极易受到污染。本专利技术给出了原多甲藻培养的最适营养盐配方，采用矿泉水桶通CO2方法培养原多甲藻，最大藻细胞密度可达6.5×106cells/ml，最高产毒达（320fg/cellAZA2），整体毒素产量提高了6倍，通过沉降絮凝方式收集的产毒藻，大大降低工作量。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种原多甲藻的培养基和培养方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供的原多甲藻培养基，包括下列重量的组分：NH4NO3，20-100mg；CO(NH2)2(尿素)，20-60mg；KH2PO4，1-10mg；碳酸氢盐，100-800mg；MnCl2·4H2O，15-50g；FeC6H5O7·5H2O(柠檬酸铁)，10-30mg；VB12，1×10-5-1×10-3mg；VB1，50-200mg；KCl，0.5-5mg；Na2EDTA10-15g；壳寡糖0.2-5g（分子量1500-2000Da）海水1000mL。优选的，本专利技术提供的原多甲藻培养基，包括下列重量的组分：NH4NO3，30mg；CO(NH2)2(尿素)，40mg；KH2PO4，5mg；碳酸氢盐，500mg；MnCl2·4H2O26g、FeC6H5O7·5H2O(柠檬酸铁)20g；VB12，1×10-4mg；VB1，100mg；KCl，3mg；Na2EDTA12.4g，壳寡糖1g（分子量1500-2000Da），海水1000mL。进一步的，本专利技术所述的碳酸氢盐选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢铵中的一种或多种的组合。优选的，所述的碳酸氢盐选自碳酸氢钠。本专利技术还提供一种上述培养基的改进配方，特征在于，在上述培养基的基础上，还包括1-3mg的氨基酸。所述的氨基酸选自极性氨基酸（亲水氨基酸）中的组合。本专利技术还提供一种原多甲藻培养基的制备方法，包括如下步骤：1)将海水灭菌待用；2)按照权利要求1中的培养基配方中的顺序和剂量依次加入到灭菌的海水中，加入后再充分搅5分钟，即可接种使用。利用本专利技术提供的培养基，本专利技术提供一种原多甲藻的扩大培养方法，包括如下步骤：第一阶段：三角烧瓶培养；海水为经0.45μm纤维膜过滤后高温灭菌的海水，盐度为30-35；添加培养基组分后，调节pH为7.9±0.3；室内培养，空调控温，20±3℃；日光灯管照明，光强5000-7000lux，光暗比12h：12h；用3000-5000mL三角烧瓶培养，工作体积占瓶体积的3/5，取对数生长期藻种接种；接种密度2×104cell/mL-5×104cell/mL；每天摇瓶6次；藻细胞密度达2×105cell/mL-3×105cell/mL，转入下一阶段培养；第二阶段：矿泉水桶培养；使用18L矿泉水桶培养，用次氯酸钠消毒海水的方法消毒矿泉水桶；消毒方法为每立方米海水中加入含有效氯20毫克/千克的次氯酸钠，将添加次氯酸钠后的灭菌海水加入矿泉水桶中，充气30分钟，停气，经3-5小时消毒后，用灭菌后的海水润洗3遍，测定无余氯存在即可使用；海水为经0.45μm纤维膜过滤后灭菌的海水，盐度为30-35，添加8L培养基组分后，瓶口用灭菌封口膜封口；导入气石充含5%二氧化碳的压缩空气保持pH为7.9±0.3，室内培养，空调控温20±3℃，双侧连续光照6000±1000LUX，光照时间15h:9h；接种密度2×103cell/mL-3×103cell/mL；每隔三天添加5L培养液，培养7-9天，藻液密度可达到1.0×106-6.5×106cell/ml，藻液呈棕黄色，收集5L左右培养液；并继续每隔三天添加5L培养液，保持密封，即可循环培养，不断收集。本专利技术的有益效果：目前，原多甲藻规模化培养存在的主要问题是藻细胞生长缓慢、倍增时间长、在扩大培养时易污染。合适的培养基和扩培容器是实现原多甲藻高密度培养的重要因素之一。以前使用的培养基没有加入碳酸氢钠，只是采用传统f/2培养基进行培养原多甲藻。本专利技术的技术方案表明，微藻除了能利用空气中游离的CO2，还能有效地利用培养液中的HCO3-作为碳源。添加NaHCO3不仅缩短了原多甲藻的倍增时间，而且延长了藻的生长时间。添加0.5g/L的NaHCO3后的培养基，营养更加全面、均衡，能大大提高原多甲藻生长速度，产量最大能提高150％。且用矿泉水桶方法培养原多甲藻，并添加0.5g/L的NaHCO3的培养条件下原多甲藻最大藻细胞密度可达6.5×105cells/ml，相较于传统玻璃锥形瓶容器培养和传统水泥池养殖方法受体积、材质限制，此培养方法一次可培养25L藻液，且材质对环境要求较低，并能保证藻种不被污染。本专利技术给出了原多甲藻培养的最适营养盐配方，可提高原多甲藻产量并降低养殖成本；通过提高Na2EDTA含量，并添加合适配比的壳寡糖以促进原多甲藻的分裂与生长；采用矿泉水桶通CO2的压缩空气的方式结合适量配比的KH2PO4缓冲溶液的调节作用，既可以中和原多甲藻生长过程中产生的次级代谢产物对于培养液的破坏，维持最适pH，且CO2能促进藻细胞光合作用。应用本法培养最大藻细胞密度可达6.5×106cells/ml，最高产毒达（320fg/cellAZA2），整体毒素产量提高了6倍。采用矿泉水桶培养原多甲藻与传统的露天开放水泥池式扩大培养相比，成本低，不易污染，易于操作，大大降低了工作量，使原多甲藻生长速度大幅本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种原多甲藻培养基，其特征在于，包括下列重量的组分：NH4NO3，20‑100mg；CO(NH2)2(尿素)，20‑60mg；KH2PO4，1‑10mg；碳酸氢盐，100‑800mg；MnCl2·4H2O，15‑50g； FeC6H5O7·5H2O(柠檬酸铁)，10‑30mg；VB12，1×10‑5‑1×10‑3mg；VB1，50‑200mg；KCl，0.5‑5mg；Na2EDTA 10‑15g；壳寡糖0.2‑5g（分子量1500‑2000Da）海水1000mL。

【技术特征摘要】
1.一种原多甲藻培养基，其特征在于，包括下列重量的组分：NH4NO3，20-100mg；CO(NH2)2(尿素)，20-60mg；KH2PO4，1-10mg；碳酸氢盐，100-800mg；MnCl2·4H2O，15-50g；FeC6H5O7·5H2O(柠檬酸铁)，10-30mg；VB12，1×10-5-1×10-3mg；VB1，50-200mg；KCl，0.5-5mg；Na2EDTA10-15g；壳寡糖0.2-5g（分子量1500-2000Da）海水1000mL。2.根据权利要求1所述的原多甲藻培养基，其特征在于，包括下列重量的组分：NH4NO3，30mg；CO(NH2)2(尿素)，40mg；KH2PO4，5mg；碳酸氢盐，500mg；MnCl2·4H2O26g、FeC6H5O7·5H2O(柠檬酸铁)20g；VB12，1×10-4mg；VB1，100mg；KCl，3mg；Na2EDTA12.4g，壳寡糖1g（分子量1500-2000Da），海水1000mL。3.根据权利要求1或2所述的原多甲藻培养基，其特征在于，所述的碳酸氢盐选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢铵中的一种或多种的组合。4.根据权利要求1或2所述的原多甲藻培养基，其特征在于，所述的碳酸氢盐选自碳酸氢钠。5.原多甲藻培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将海水灭菌待用；2)按照权利要求1中的培养基配方中的顺序和剂量依次加入到灭菌的海水中，加入后再充分搅5分钟，即可接种使用。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，吴海燕，李清云，谭志军，彭吉星，郭萌萌，翟毓秀，
申请(专利权)人：青岛科技大学，中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37