破骨细胞培养基及其制备方法和培养破骨细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种破骨细胞培养基、其制备方法和培养破骨细胞的方法，破骨细胞培养基包括骨髓细胞培养基和诱导培养基；骨髓细胞培养基为含有巨噬细胞集落刺激因子(M‑CSF)10‑40μg/L、含14‑16％体积分数血清的基础培养液；诱导培养基为含20‑70ng/mLRANKL、10‑40ng/mL M‑CSF、0.1‑1μm/mL 1,25(OH)2D3、2‑5ng/mL甲状旁腺激素、6‑10ng/mL白细胞介素、2‑8ng/mL肿瘤坏死因子α、8‑12ng/mL前列腺素E2和2‑5ng/mL地塞米松的基础培养液。通过对培养基的组分特定的选择，对骨髓中细胞分步进行培养纯化以及诱导，实现了快速大量制备破骨细胞的效果。

Osteoclast culture medium, preparation method thereof and method for culturing osteoclast

The present invention provides an osteoclast culture medium and its preparation method and cultivation method of osteoclasts and osteoclast culture medium including bone marrow cell culture medium and induction medium; bone marrow cell culture medium containing macrophage colony stimulating factor (M CSF) in 10 40 g/L, containing 14 16% volume fraction of serum medium; inducing medium containing 20 70ng/mLRANKL, 10 40ng/mL M CSF, 0.1 1 m/mL 1,25 (OH) 2D3, 2 5ng/mL, 6 parathyroid hormone 10ng/mL, interleukin 2, tumor necrosis factor alpha, 8ng/mL 8 12ng/mL of prostaglandin E2 and 2 5ng/mL dexamethasone medium. Through the selection of the specific components of the culture medium, the cells in bone marrow were cultured and purified step by step, and the effect of rapid and large amount of osteoblasts was achieved.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学领域，具体而言，涉及一种破骨细胞培养基、其制备方法和培养破骨细胞方法。
技术介绍
人体的骨组织中含有成骨细胞和破骨细胞，共同负责完成骨吸收和骨形成两个骨重塑过程，两者处于动态平衡。破骨细胞是主要的骨吸收细胞，来源于骨髓造血干细胞，由骨髓中的多个单核巨噬细胞融合而成。破骨细胞数量和活性的增加与多种骨质流失的临床疾病密切相关，包括骨质疏松、慢性肾脏病并发的矿物质和骨代谢紊乱；破骨细胞还主导骨移植物的骨吸收作用和炎症性骨丢失等。这些疾病及其引发的骨折将严重影响患者的生活质量和生存时间。因此，为了在矿物质和骨代谢紊乱的发病机制与治疗方面寻求突破，破骨细胞成为相关研究的重点。随着时间的推移和科技的进步，破骨细胞的培养方法也日新月异。破骨细胞主要分布于骨质表面与骨内血管通道周围的小陷窝内。破骨细胞主要的生理功能是溶解与吸收骨质，参与骨组织的重建和维持血钙的动态平衡。由于破骨细胞独特的功能，对破骨细胞的研究在阐明骨代谢性疾病的病理生理机制以及为疾病诊疗提供新方法中具有至关重要的意义。然而，破骨细胞是高代谢终末分化细胞，具有不能传代、存活时间短等特点，且破骨细胞在体内数量极少，难以分离获得。目前，破骨细胞培养方法主要有：机械分离法、骨髓单核细胞诱导培养法、脾脏造血干细胞培养法以及血液单核细胞诱导分化培养法等；这些方法不可避免都要使用培养液对细胞进行培养，且不同的阶段采用不同配方的培养液进行，目前常见的原代细胞培养液多为含有血清的基础培养液，诱导过程中则选择添加诱导剂促使破骨细胞分化。然而，现有技术中诱导培养过程中所用的诱导剂单一简单，诱导分化破骨细胞的效果并不理想，因此，提供一种可高效获得破骨细胞的培养基是本领域亟待解决的一个技术问题。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种用于体外培养制备破骨细胞的培养基，以期通过改良培养基的组成从而提高破骨细胞的得率，为大量获得破骨细胞提供保障。本专利技术的第二目的在于提供一种所述培养基的制备方法，以实现该培养基的快速制备。本专利技术的第三目的在于提供一种利用所述的培养基制备破骨细胞的方法，该方法合理利用培养基，在不同的阶段采用不同的培养基，通过前期的提取纯化培养以及后续的诱导培养体外制备破骨细胞，简化了体外制备破骨细胞的流程。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术提供了一种破骨细胞培养基，所述培养基包括：骨髓细胞培养基和诱导培养基；其中，所述骨髓细胞培养基为含有巨噬细胞集落刺激因子10-40μg/L、含14-16％体积分数血清的基础培养液；所述诱导培养基为含有20-70ng/mLRANKL、10-40ng/mLM-CSF、0.1-1μm/mL1,25(OH)2D3、2-5ng/mL甲状旁腺激素、6-10ng/mL白细胞介素、2-8ng/ml肿瘤坏死因子α、8-12ng/mL前列腺素E2和2-5ng/mL地塞米松的基础培养液。本专利技术提供的培养基含有骨髓细胞培养基和诱导培养基，该两种培养基的基础组分均为细胞基础培养液，并且用于破骨细胞不同制备阶段细胞的培养，较为特殊的是，在骨髓细胞培养基中加入了特定含量的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和血清，M-CSF是一种具有谱系特异性的细胞因子。M-CSF为链间二硫键连接而成的二聚体糖蛋白，其对单核细胞的增殖、分化及维持其活性有重要促进作用，其次其在培养基中浓度选择合理，为骨髓间质单核细胞的大量增殖提供了先决条件，另外，经过实验验证，14-16％体积分数的血清对于形成体积大，胞浆丰满，细胞突起延展，细胞核呈圆形或椭圆形的培养细胞具有重要的促进作用。在诱导培养基中，本专利技术创造性地加入了RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲状旁腺激素、白细胞介素、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2和地塞米松等诱导因子，而且对各诱导因素在培养液中的浓度进行了限定，各诱导因子在协同的作用下，活使得经过前期培养获得的骨髓间质细胞能够大量地分化为破骨细胞，进而提高了破骨细胞的得率。可选的，所述基础培养液包括α-MEM培养液，DMEM，RPMI-1640，F12，M199，DMEM/F12中的一种或几种。为了提供本专利技术的培养基的应用效果，基础培养液可以采用上述所列的多种成熟培养液，其中，综合考虑培养效果，以α-MEM培养液为优选基础培养液，在另一优选的方案中，基础培养液为DMEM，RPMI-1640，F12，M199，DMEM/F12等体积的混合物。可选的，所述血清为胎牛血清、马血清和羊血清中的一种或几种。血清是很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。上述所列血清的主要成份有:①蛋白质：是血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白、球蛋白。纤维粘连素细胞促进细胞附着；血清中巨球蛋白有抑制胰蛋白酶的作用；胎球蛋白促细胞附着；转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。②多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。③激素：激素对细胞的作用是多方面的，胰岛素促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。类胰岛素生长因子能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。促生长激素能够促细胞增殖效应。血清中含有定量的氢化可的松，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用。可选的，所述诱导培养基中，还含有体积分数占8-9％的胎牛血清。基于上述血清对细胞增殖所具备的促进作用，本申请中，在诱导培养基中也优选加入体积分数占8-9％的胎牛血清，鉴于细胞密度高时，血清中的氢化可的松可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化，因此，本申请诱导培养基中所加入的胎牛血清的体积分数为8-9％。可选的，所述诱导培养基中，所述白细胞介素包括白细胞介素-1和白细胞介素-6。可选的，所述诱导培养基中，所述白细胞介素-1与所述白细胞介素-6的浓度比为1-3。白细胞介素的种类繁多，且功能非常复杂，在本申请中，优选白细胞介素-1和白细胞介素-6，该两种白细胞介素(尤其是其浓度比为1-3)时，可与诱导培养基中的其他诱导因素产生协同效果，共同促进破骨细胞的分化。上述的破骨细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：配制基础培养液，并在基础培养液中先加入既定体积分数的血清，然后再加入巨噬细胞集落刺激因子，使其浓度为10-40μg/L，得到骨髓细胞培养基；在另一基础培养液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲状旁腺激素、白细胞介素、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2和地塞米松，使得各试剂达到预定浓度，得到诱导培养基。上述的制备方法中，先制备基础培养液并且定量，然后在基础培养液中加入巨噬细胞集落刺激因子以及血清，或者在基础培养液中加入RANKL、M-CSF、1,25(OH)2D3、甲状旁腺激素、白细胞介素、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2和地塞米松，实现培养基的制备，需要指出的是，本专利技术提供的培养基的组分是预先混在一起的，因此在未使用时，应在低温条件下保藏，防止其失去活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种破骨细胞培养基，其特征在于，所述培养基包括：骨髓细胞培养基和诱导培养基；其中，所述骨髓细胞培养基为含有巨噬细胞集落刺激因子(M‑CSF)10‑40μg/L、含14‑16％体积分数血清的基础培养液；所述诱导培养基为含有20‑70ng/mL RANKL、10‑40ng/mL M‑CSF、0.1‑1μm/mL 1,25(OH)2D3、2‑5ng/mL甲状旁腺激素、6‑10ng/mL白细胞介素、2‑8ng/mL肿瘤坏死因子α、8‑12ng/mL前列腺素E2和2‑5ng/mL地塞米松的基础培养液。

【技术特征摘要】
1.一种破骨细胞培养基，其特征在于，所述培养基包括：骨髓细胞培养基和诱导培养基；其中，所述骨髓细胞培养基为含有巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)10-40μg/L、含14-16％体积分数血清的基础培养液；所述诱导培养基为含有20-70ng/mLRANKL、10-40ng/mLM-CSF、0.1-1μm/mL1,25(OH)2D3、2-5ng/mL甲状旁腺激素、6-10ng/mL白细胞介素、2-8ng/mL肿瘤坏死因子α、8-12ng/mL前列腺素E2和2-5ng/mL地塞米松的基础培养液。2.根据权利要求1所述的破骨细胞培养基，其特征在于，所述基础培养液包括α-MEM培养液，DMEM，RPMI-1640，F12，M199，DMEM/F12中的一种或几种。3.根据权利要求2所述的破骨细胞培养基，其特征在于，所述血清为胎牛血清、马血清和羊血清中的一种或几种。4.根据权利要求3所述的破骨细胞培养基，其特征在于，所述诱导培养基中，还含胎牛血清。5.根据权利要求1-4任一项所述的破骨细胞培养基，其特征在于，所述诱导培养基中，所述白细胞介素包括白细胞介素-1和白细胞介素-6。6.根据权利要求5所述的破骨细胞培养基，其特征在于，所述诱导培养基中，所述白细胞介素-1与所述白细胞介素-6的浓度比为1-3。7.一种权利要求1-6任一项所述的破骨细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：配制基...

【专利技术属性】
技术研发人员：段莉，王大平，贾兆锋，徐晓，刘启颂，陈洁琳，刘威，熊建义，杜雨霞，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44