本发明专利技术公开了一种灰略红链霉菌耐高温中性蛋白酶及其编码基因和应用。该蛋白酶基因从灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，上述编码的耐高温中性蛋白酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明专利技术通过在重组蛋白C端添加聚组氨酸标签(HIS6·Tag)，保证了蛋白活性的同时，也便于蛋白酶的纯化。本发明专利技术的蛋白酶具有较宽的适用温度和pH范围，特别是在较高温度55℃下能表现出很好的酶活性；且对多种金属离子及酶活性抑制剂(EDTA、DTT、SDS和NaN3)均有较强的耐受能力。
High temperature resistant neutral protease of Streptomyces sp., encoding gene and application thereof
The present invention discloses one kind of thermostable neutral protease of Streptomyces and its coding gene and application. The protease gene from Streptomyces griseorubens (Streptomyces griseorubens) was cloned and the nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 shows, the encoding thermostable neutral protease, the amino acid sequence of SEQ ID NO.2. By adding the histidine tag (HIS6 * Tag) at the C end of the recombinant protein, the invention ensures the protein activity and is convenient for the purification of the protease. The protease of the invention has wide applicable temperature and pH range, especially can exhibit good enzyme activity at high temperature of 55 DEG C; and for a variety of metal ions and inhibitors of enzyme activity (EDTA, DTT, SDS and NaN3) have strong tolerance.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和现代酶工程
，涉及一种灰略红链霉菌耐高温中性蛋白酶及其编码基因和应用，具体涉及一种耐高温中性蛋白酶及其编码基因序列、含有该编码基因序列的重组表达载体和转基因重组菌以及该耐高温中性蛋白酶的应用。
技术介绍
蛋白酶作为催化蛋白质多肽链中的肽腱水解的一类酶，广泛存在于植物茎叶果实、人和动物内脏及微生物(主要是细菌、真菌和放线菌)。细菌作为微生物蛋白酶的主要来源之一，其合成的蛋白酶具有较强的水解能力，因而在工业生产中具有更加广泛的应用。目前，产蛋白酶细菌研究最深入的是芽孢杆菌，主要有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslichniformis)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumillus)等；枯草芽孢杆菌作为一种被美国食品药物管理局认可的安全菌种(无致病性、环境友好及抗逆性强)，是蛋白酶制剂大规模产业化的主要菌种，其能够产生酸性、中性及碱性蛋白酶，但以中性及碱性蛋白酶居多。一般而言，真菌合成分泌的蛋白酶种类多于细菌，然而真菌合成分泌的蛋白酶水解能力相对较低，并且稳定性及耐热性较差，产蛋白酶真菌主要有曲霉属和毛霉属，另外还有酵母菌，如嗜热圆酵母、解脂假丝酵母。相对而言，产蛋白酶的放线菌种类较少，针对其展开的研究和获得的成果也较少，产蛋白酶的放线菌主要有灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、氟氏链霉菌(Streptomycesfradiae)以及变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)。经证实，链霉菌蛋白酶具有较强的热稳定性，能够耐受50℃以上的高温，且对多种金属离子及酶活抑制剂有较强的耐受能力。因此，链霉菌对于新型蛋白酶的研发具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种耐高温中性蛋白酶。本专利技术的另一目的在于提供一种耐高温中性蛋白酶的编码基因。本专利技术的另一目的在于提供一种含有上述的耐高温中性蛋白酶编码基因的重组表达载体或转基因重组菌。本专利技术的另一目的在于提供一种上述的耐高温中性蛋白酶编码基因在表达耐高温中性蛋白酶中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种上述的耐高温中性蛋白酶在降解蛋白质中的应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现：一种灰略红链霉菌耐高温中性蛋白酶，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。本专利技术提供的耐高温中性蛋白酶及其编码基因克隆自灰略红链霉菌(Streptomycesgriseorubens)，命名为JSD-1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2012.01.09，保藏编号为CGMCCNo.5706，具有下列核苷酸序列之一：(1)序列表中的SEQIDNO.1的核苷酸序列；(2)编码序列表中的SEQIDNO.2氨基酸序列的多核苷酸。本专利技术的一种灰略红链霉菌耐高温中性蛋白酶编码基因序列是通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获得，所涉及的实验技术包括链霉菌基因组及大肠杆菌质粒DNA的提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶回收、连接、质粒酶切、转化、蛋白诱导表达及纯化、聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白酶活性的测定等；具体步骤为：以灰略红链霉菌基因组为模板，通过PCR扩增获得该蛋白酶编码基因序列，随后将该基因序列连接到表达载体pET-22b(+)上，并将重组质粒导入到特定的大肠杆菌表达菌株内，进而获得蛋白酶过表达重组菌株，最终通过IPTG诱导实现蛋白酶的体外高效表达，并收集菌体、破碎菌体，离心后获得粗酶液，之后进行蛋白纯化并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达情况，最后，测定该蛋白酶相关的酶学特征。从灰略红链霉菌得到的耐高温中性蛋白酶具有以下特征：1、该耐高温中性蛋白酶的编码基因长度为519bp，共编码172个氨基酸。2、该耐高温中性蛋白酶的适合反应温度为40～65℃，优选为45～60℃。3、该耐高温中性蛋白酶的适合反应的pH为5.0～11.0，优选pH为6.0～9.0。4、该耐高温中性蛋白酶分别在1mM金属离子和1mM酶活性抑制剂下，对多种金属离子(Na+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Hg2+、Cd2+和Fe2+)及酶活性抑制剂(EDTA、DTT、SDS和NaN3)均有较强的耐受能力，Zn2+可提高蛋白酶的活性，而EDTA可较大程度抑制该蛋白酶的活性。上述的耐高温中性蛋白酶编码基因的重组表达载体或转基因重组菌株。所述的重组表达载体为将上述的耐高温中性蛋白酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达耐高温中性蛋白酶的重组表达载体，所述的大肠杆菌重组表达载体为pET-22b(+)载体。所述的转基因重组菌为将上述的重组表达载体导入到大肠杆菌中，筛选得到表达耐高温中性蛋白酶的转基因重组菌，所述的大肠杆菌为Transetta(DE3)。上述的耐高温中性蛋白酶编码基因在表达耐高温中性蛋白酶中的应用。上述的耐高温中性蛋白酶及其编码基因在降解蛋白质中的应用。一种表达耐高温中性蛋白酶的方法，是培养上述的转基因重组菌得到耐高温中性蛋白酶。本专利技术所述的耐高温中性蛋白酶在天然的灰略红链霉菌内表达量和酶活性均较低，因此严重限制了其使用范围和效果。本专利技术利用基因工程技术，构建了该蛋白酶表达工程菌株，大幅度提高了目的蛋白酶的表达量，为该蛋白酶的高效表达与应用奠定了基础，可用于蛋白质的降解。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：第一.本专利技术通过构建外源表达载体，实现了该蛋白酶的体外过表达，并在重组蛋白C端添加聚组氨酸标签(HIS6·Tag)的方法，保证蛋白生物学活性的同时也方便后续蛋白的纯化；第二.本专利技术通过载体信号肽实现了目的蛋白的周质空间表达，保证了蛋白酶的活性和稳定性；第三.本专利技术的耐高温中性蛋白酶的适用反应温度范围广，在35～65℃下都能保持较好的活性，特别是相比现有的蛋白酶，本专利技术的蛋白酶在较高温度55℃下，表现出很好的酶活性；同时本专利技术的蛋白酶的适用pH范围广，在pH为5～11下都能保持较好的活性；第四.本专利技术的耐高温中性蛋白酶对多种金属离子(Na+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Hg2+、Cd2+和Fe2+)及酶活性抑制剂(EDTA、DTT、SDS和NaN3)均有较强的耐受能力，这可降低酶在生产过程中对水和蛋白原料的纯度要求，避免了生产过程中的金属离子对酶活性的影响，提高了实际应用时的稳定性。附图说明图1为本专利技术的耐高温中性蛋白酶的基因序列片段PCR扩增图；图2为本专利技术的耐高温中性蛋白酶编码基因的重组表达载体的酶切片段的示意图；图3为本专利技术的重组蛋白酶外源表达的验证图；图4为本专利技术的耐高温中性蛋白酶在不同温度(30～70℃)下蛋白酶活性的示意图；图5为本专利技术的耐高温中性蛋白酶在不同pH值(3.0～11.0)溶液下蛋白酶活性的示意图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应该理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用于限定本专利技术的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本专利技术做出的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。1、灰略红链霉菌基因组提取和测序将灰略红链霉菌孢子悬浮液接种于LB液体培养基中，于37℃、150rpm条件下培养3天，然后收集2.0mL菌液，12000rpm离心2min，并弃上清，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种灰略红链霉菌耐高温中性蛋白酶，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
【技术特征摘要】
1.一种灰略红链霉菌耐高温中性蛋白酶，其特征在于，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。2.权利要求1所述的耐高温中性蛋白酶的编码基因。3.根据权利要求2所述的耐高温中性蛋白酶的编码基因，其特征在于，所述的耐高温中性蛋白酶的编码基因具有序列表中的SEQIDNO.1的核苷酸序列。4.含有权利要求2或3所述的耐高温中性蛋白酶编码基因的重组表达载体。5.含有权利要求2或3所述的耐高温中性蛋白酶编码基因的转基因重组菌。6.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体为将权利要求2或3所述的耐高温中性蛋白酶的编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得...
【专利技术属性】
技术研发人员：支月娥，周培，冯海玮，孙玉静，程铭，聂文翰，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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