可编码ArtRD蛋白基因及其蛋白和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种可编码ArtRD蛋白基因，基因序列如SEQ ID NO：4所示，这种基因所编码的ArtRD蛋白，主要在血管平滑肌细胞(VSMC)中，能促进VSMC表型转换，加重血管重构，ArtRD蛋白的表达及其对应抗体的制备，为下一步研究心脑血管疾病治疗策略提供研究基础。

Encoding ArtRD protein gene, protein and application thereof

The invention relates to a gene encoding ArtRD protein gene sequences, such as SEQ ID NO:4 shows, the gene encoding the ArtRD protein, mainly in vascular smooth muscle cells (VSMC), VSMC can promote the phenotypic conversion, increased vascular remodeling, the expression of ArtRD protein and its antibody preparation, research the foundation for the next treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases strategy.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程技术及基础医学领域，涉及可编码ArtRD蛋白基因及其蛋白和应用。
技术介绍
长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)泛指长度大于200nt，不能翻译产生蛋白质的一类转录本。与编码蛋白质的mRNA相比，lncRNA种类更多，组织表达特异性更强，表达丰度较低，物种间的保守性也较差。lncRNA虽不能翻译合成蛋白质，但仍具有强大的基因调控能力，能够通过对编码蛋白质的RNA的调控，参与到生物发育、疾病发生等诸多环节当中。事实上，lncRNA与能够编码蛋白质的mRNA具有众多相似之处：他们的转录均依赖于RNA聚合酶II，且都需要经历剪接、加帽、加尾等转录后修饰，部分lncRNA也能够与细胞核糖体结合，这些特征都提示部分lncRNA可能具有潜在编码蛋白质的能力。由于目前lncRNA的发现多依赖于高通量测序(RNA-seq)，而其注释主要依靠生物信息学工具，正因如此，许多隐藏在lncRNA序列中的较短的开放阅读框(openreadingframe,ORF)被忽视掉了。前期已有部分研究，报道了在线虫和果蝇等低等生物中发现从lncRNA中合成的短肽，而在哺乳动物中，也相继发现了三种从注释为lncRNA的转录本中编码出的短肽，参与骨骼肌收缩及损伤后修复等重要生物学功能。然而，以上报道均是在研究lncRNA时偶然的发现，并没有形成一套固定的研究方法，相信还会有更多的潜藏在lncRNA中的具有重要功能的蛋白质被发掘。分布在血管壁中层的血管平滑肌细胞，与血管功能关系密切，生理状态下血管平滑肌细胞的增殖能力和分泌活性都很低；然而在受到胞外不良因素刺激后，平滑肌细胞会发生去分化，失去成熟平滑肌细胞的功能和分化标志，而增殖和迁移能力显著增强。血管平滑肌细胞的表型转换是动脉粥样硬化、高血压的血管重构中的关键环节。因此，寻找到调控血管平滑肌细胞表型转换的因素，有助于更好地理解心脑血管疾病发生发展的机制，为寻找新的治疗策略提供线索，这也是多年来全球科学家共同努力攻克的命题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于(1)提供一种可编码ArtRD蛋白基因；(2)基因序列如SEQIDNO：4所编码的ArtRD蛋白；(3)由ArtRD蛋白制备出抗体；(4)ArtRD蛋白作为靶点在生物学上检测、标志物中或在平滑肌细胞表型转化试剂中的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种可编码ArtRD蛋白基因，其所述基因序列如SEQIDNO：4所示。由基因序列SEQIDNO：4编码的ArtRD蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。包含ArtRD蛋白的融合蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQIDNO：7所示。包含ArtRD蛋白的融合蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQIDNO：9所示。一种重组蛋白载体，由空载体和插入该空载体的ArtRD蛋白基因组成。进一步，空载体为PGEX-4t-1或pcDNA3.1(+)。由基因序列SEQIDNO：4编码的ArtRD蛋白作为抗原制备得到的抗体。进一步，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。检测ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的试剂在制备检测高血压试剂盒中的应用。检测ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的试剂在制备检测血管平滑肌细胞表型转化试剂盒中的应用。ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的抑制剂在制备降低血管平滑肌增殖迁移试剂中的应用。进一步，所述抑制剂为含有干扰序列如SEQIDNO：14所示的shRNA慢病毒载体。本专利技术的有益效果在于：从lncRNA中研究出可编码为ArtRD蛋白的基因，并克隆出的一种血管组织表达特异性的ArtRD蛋白，识别其生物学功能，ArtRD蛋白能够促进血管平滑肌细胞表型转换，参与高血压及血管重塑等病理过程的发生发展。本专利技术SEQIDNO：4所示可编码ArtRD蛋白基因，及其可表达的ArtRD蛋白对进一步研究血管平滑肌细胞病理生理功能、血管重构相关疾病发生发展提供基础。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为ArtRD原核表达SDS-PAGE鉴定；图2为ArtRD原核表达纯化蛋白SDS-PAGE鉴定图3为ArtRD纯化后特异性抗体SDS-PAGE鉴定；图4为ArtRD在大鼠不同组织中的表达情况；图5为FLAG-ArtRD过表达于HEK293a细胞，IP及WB检测；图6为慢病毒shRNA干扰ArtRD表达后，VSMC分化标记蛋白改变情况；图7为FLAG-ArtRD质粒转染VSMC后，VSMC分化标记蛋白改变情况；图8为FLAG-ArtRD质粒转染VSMC后，ArtRD与FLAG表达及共定位情况。其中：图1泳道M：蛋白分子量标志泳道1：未经IPTG诱导；泳道2：0.5mMIPTG诱导后；泳道3：37℃0.5mMIPTG诱导后上清液；泳道4：37℃0.5mMIPTG诱导后沉淀；图2：泳道M：蛋白分子量标志；泳道1：未经GST亲和层析柱纯化蛋白溶液；泳道2：GST亲和层析柱通过蛋白溶液；泳道3：GST亲和层析柱洗脱液。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。部分材料如下：1.载体和感受态细胞：PGEX-4t-1质粒(钟鼎生物保存)，pcDNA3.1(+)质粒(Invitrogen)，TOP10菌株(钟鼎生物保存)，DH5α感受态细胞(TIANGEN)。2.分子生物学试剂与培养基：限制性内切酶及T4连接酶(NEB)，PCR相关试剂(TAKARA)，WB所用抗体均购自Abcam公司，WBSDS-PAGE配置试剂盒购自碧云天公司，RASAL2-AS1shRNA由汉恒生物合成，anti-FLAGM2beads购自Sigma公司，DMEM高糖培养基及胎牛血清购自Gibco公司。3.细胞：大鼠VSMCA10细胞系、HEK293a细胞系均由第三军医大学大坪医院心血管病实验室保种。4.实验动物：新西兰白兔(雄性，2-2.5kg)购自南京模式动物研究所。实施例一、ArtRD的发现通过长链非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)芯片检测，比较了自发性高血压大鼠(SHR)与正常血压大鼠(WKY)主动脉组织中差异性表达的lncRNA。在差异性表达的lncRNA中，关注到了一条在Refseq数据库中注释为lncRNA的转录本NR_027983，由于其位于RASAL2基因反义链上，将其命名为lncRNARASAL2-AS1(RASAL2antisense1)，如序列SEQIDNO：1所示。lncRNARASAL2-AS1在高血压大鼠的主动脉组织中高表达，并且特异性分布于血管组织中，在人的转录本NR_027982humanRASAL2-AS1(如序列SEQIDNO：2所示)和小鼠转录本NR_027984mouseRASAL2-AS(如序列SEQIDNO：3所示)的基因组中具有同源序列，上述序列在数据库中均注释为lncRNA。数据库对于lncRNA的注释基于生物信息学分析，但并未通过实验验证其实际能否编码。使用NCBIORFFinder在线工具分析lncRNARAS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可编码ArtRD蛋白基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO：4所示。

【技术特征摘要】
1.一种可编码ArtRD蛋白基因，其特征在于，所述基因序列如SEQIDNO：4所示。2.由权利要求1基因序列编码的ArtRD蛋白，其特征在于，所述蛋白氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。3.包含权利要求2所述ArtRD蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白氨基酸序列如SEQIDNO：7或SEQIDNO：9所示。4.一种重组蛋白载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述ArtRD蛋白基因。5.根据权利要求5所述重组蛋白载体，其特征在于，所述空载体为PGEX-4t-1或pcDNA3.1(+)。6.由权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾春雨，吴庚泽，余骏逸，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50