大肠癌相关microRNA检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种大肠癌相关microRNA检测试剂盒，包括有：针对每种待检测的大肠癌相关microRNA有至少一条一级信号放大探针、至少一条二级信号放大探针、和至少一条三级信号放大探针，以及捕获探针，所述大肠癌相关microRNA的捕获探针的P1序列选自SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.10。本发明专利技术所选择的捕获探针和信号放大探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使鉴定试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。

Colorectal cancer associated microRNA detection kit

The invention relates to a colorectal cancer related microRNA detection kit, including: for each detected colorectal cancer related microRNA has at least one level signal amplifying probe, at least a two signal amplifying probe, and at least a three signal amplifying probe and capture probe, the capture probe colorectal cancer related microRNA P1 SEQ ID NO.1 sequence from SEQ ID NO.10. The present invention selected capture probe and signal amplification to probe hybridization reaction in the reaction conditions of uniform, there is no non-specific binding between the various probes; the designed probe in the detection of specific resistance, high signal-to-noise ratio. At the same time, the use of a variety of probes makes the identification kit and detection method to form a system with good detection effect.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种大肠癌相关microRNA检测试剂盒。
技术介绍
MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，通过碱基互补配对的方式识别靶miRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶miRNA或者阻遏靶miRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。在世界范围内，大肠癌(colorectalcancer,CRC)在恶性肿瘤中排第3位，在癌症引起死亡病例中排第4位，每年大约有100多万的新病例。大肠癌的发生是一个连续逐步的过程，它可以从腺瘤逐渐发展成为腺癌及远处传播。近年来研究证实microRNA(miRNA,微小核糖核酸)与大肠癌相关基因表达调控密切相关。在大肠癌中，多种miRNAd表达谱差异上升或下调，如常见的上调miRNA包括：miR-17,miR-18a,miR-19a,miR-19b,miR-20a,miR-96,miR-145等，而常见的下调miRNA主要有：miR-9,miR-30a,miR-124a,miR-133a,miR-192,miR-375等。有研究者通过检测197例结肠癌组织中的miRNA的表达，发现37种miRNA的表达存在差异，其中miR-20a,miR-21,miR-106,miR-181b,miR-203的表达升高，其中又以miR-21的升高最显著。此外，研究还发现结肠癌细胞中，miR-143和miR-145表达极度下调，提示这两者可能发挥抑癌作用。目前，针对miRNA的检测方法主要有NorthernBlot、基因芯片、荧光定量探针法、基于微球的流式细胞术技术。但NorthernBlot方法敏感度低、耗时长且RNA的用量较大，不适合高通量分析；基因芯片技术能实现miRNA的高通量分析，即在一块芯片上同时检测多个miRNA，但缺点是结果准确性低，重复性差，实验价格昂贵；荧光定量探针法检测灵敏度高，但检测费用昂贵；而基于微球的流式细胞术技术将探针固定于微球上并置于液相中，更有利于捕获miRNA序列，因此提高了准确性，但是由于miRNA同源性高，长度较短，细胞或组织内含量低，针对它的高灵敏高选择性检测方法仍然有待进一步完善。原位杂交技术是一种定位和形态学检测保存的组织切片或细胞制备物中特异性miRNA序列的方法。然而目前现有技术中对miRNA的多重平行检测仍存在许多困难。首先，需要分别制备各靶miRNA的标记探针；其次，难以同时原位检测多种靶miRNA的表达。因此，目前报道的对多种miRNA的检测只能用不同的标记方法，然而，用不同的标记方法不能很好地控制探针与细胞中非特异性序列可能的交叉杂交。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的大肠癌相关microRNA检测试剂盒。实现上述目的的技术方案如下。一种大肠癌相关microRNA检测试剂盒，包括有：针对每种待检测的大肠癌相关microRNA有至少一条一级信号放大探针、至少一条二级信号放大探针、和至少一条三级信号放大探针，以及捕获探针，所述大肠癌相关microRNA选自:hsa-miR-21-5p、hsa-miR-602、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-203a-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-17-3p以及hsa-miR-92a-3p中的至少一种，其中：所述捕获探针用于连接目标核酸与一级信号放大探针，每条捕获探针从5’端到3’端依次为特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列，针对不同目标基因的P2序列互不相同；所述一级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P4序列、间隔臂序列、P3序列，P3序列与P2序列互补配对；所述二级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P4序列含有至少一个与P5序列互补配对的碱基片段，且每个与P5序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列；所述三级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P8序列、间隔臂序列、P7序列，所述P8序列5’端还修饰有荧光基团，针对不同目标核酸的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同；所述P6序列含有至少一个与P7序列互补配对的碱基片段，且每个与P7序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列；所述P2序列、P3序列、P4序列、P5序列、P6序列、P7序列、P8序列均为不存在发夹结构，各探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与整个检测体系的其它核酸之间均不存在特异性结合的序列；所述待检测的大肠癌相关miRNA的捕获探针的P1序列选自以下至少一种：针对hsa-miR-21-5p的SEQIDNO.1，针对hsa-miR-602的SEQIDNO.2，针对hsa-miR-143-3p的SEQIDNO.3，针对hsa-miR-145-5p的SEQIDNO.4，针对hsa-miR-20a-5p的SEQIDNO.5，针对hsa-miR-181b-5p的SEQIDNO.6，针对hsa-miR-203a-3p的SEQIDNO.7，针对hsa-miR-27a-3p的SEQIDNO.8，针对hsa-miR-17-3p的SEQIDNO.9，针对hsa-miR-92a-3p的SEQIDNO.10。在其中一个实施例中，所述P2序列选自：所述P2序列选自：SEQIDNO.11～SEQIDNO.20；所述P5序列选自：SEQIDNO.31～SEQIDNO.40，所述P7序列选自：SEQIDNO.51～SEQIDNO.60；所述P4序列中的所述间隔臂序列为3—10个T；所述P6序列的所述间隔臂序列为2—10个T；P8序列为polyT。在其中一个实施例中，所述polyT为3-10个T。在其中一个实施例中，所述P4序列选自：SEQIDNO.21～SEQIDNO.30，所述P6序列选自：SEQIDNO.41～SEQIDNO.65。在其中一个实施例中，所述一级信号放大探针中所述P4序列与P3序列之间的间隔臂序列选自5－20个T；二级信号放大探针中所述P5序列与P6序列之间的间隔臂序列选自5－10个T；三级信号放大探针中P7序列与P8序列之间的间隔臂序列选自3－10个T。在其中一个实施例中，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488，且针对不同目标核酸的荧光基团互不相同。本专利技术的主要优点在于：(1)本专利技术提供一种miRNA的检测捕获探针，所述的捕获采用的三明治结构(与靶标miRNA反向互补序列P1—间隔序列—与一级信号放大探针P3序列互补结合的P2序列)，与现有技术相比，该设计更为简单，更具有实用性。而且本技术方案所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠癌相关microRNA检测试剂盒，其特征在于，包括有：针对每种待检测的大肠癌相关microRNA有至少一条一级信号放大探针、至少一条二级信号放大探针、和至少一条三级信号放大探针，以及捕获探针，所述大肠癌相关hsa‑miR‑21‑5p、hsa‑miR‑602、hsa‑miR‑143‑3p、hsa‑miR‑145‑5p、hsa‑miR‑20a‑5p、hsa‑miR‑181b‑5p、hsa‑miR‑203a‑3p、hsa‑miR‑27a‑3p、hsa‑miR‑17‑3p以及hsa‑miR‑92a‑3p中的至少一种，其中：所述捕获探针用于连接目标核酸与一级信号放大探针，每条捕获探针从5’端到3’端依次为特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列，针对不同目标基因的P2序列互不相同；所述一级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P4序列、间隔臂序列、P3序列，P3序列与P2序列互补配对；所述二级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P4序列含有至少一个与P5序列互补配对的碱基片段，且每个与P5序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列；所述三级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P8序列、间隔臂序列、P7序列，所述P8序列5’端还修饰有荧光基团，针对不同目标核酸的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同；所述P6序列含有至少一个与P7序列互补配对的碱基片段，且每个与P7序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列；所述P8序列为polyT；所述P2序列、P3序列、P4序列、P5序列、P6序列、P7序列、P8序列均为不存在发夹结构，各探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与整个检测体系的其它核酸之间均不存在特异性结合的序列。...

【技术特征摘要】
1.一种大肠癌相关microRNA检测试剂盒，其特征在于，包括有：针对每种待检测的大肠癌相关microRNA有至少一条一级信号放大探针、至少一条二级信号放大探针、和至少一条三级信号放大探针，以及捕获探针，所述大肠癌相关hsa-miR-21-5p、hsa-miR-602、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-203a-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-17-3p以及hsa-miR-92a-3p中的至少一种，其中：所述捕获探针用于连接目标核酸与一级信号放大探针，每条捕获探针从5’端到3’端依次为特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列，针对不同目标基因的P2序列互不相同；所述一级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P4序列、间隔臂序列、P3序列，P3序列与P2序列互补配对；所述二级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P4序列含有至少一个与P5序列互补配对的碱基片段，且每个与P5序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列；所述三级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P8序列、间隔臂序列、P7序列，所述P8序列5’端还修饰有荧光基团，针对不同目标核酸的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同；所述P6序列含有至少一个与P7序列互补配对的碱基片段，且每个与P7序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列；所述P8序列为polyT；所述P2序列、P3序列、P4序列、P5序列、P6序列、P7序列、P8序列均为不存在发夹结构，各探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与整个检测体系的其它核酸之间均不存在特异性结合的序列。2.根据权利要求1所述的大肠癌相关microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述待检测的大肠癌相关miRNA的捕获探针的P1序列选自以下至少一种：针对hsa-miR-21-5p的SEQIDNO.1，针对hsa-miR-602的SEQIDNO.2，针对hsa-miR-143-3p的SEQIDNO.3，针对hsa-miR-145-5p的SEQIDNO.4，针对hsa-miR-20a-5p的SEQIDNO.5，针对hsa-miR-181b-5p的SEQIDNO.6，针对hsa-miR-203a-3p的SEQIDNO.7，针对hsa-miR-27a-3p的SEQIDNO.8，针对hsa-miR-17-3p的SEQIDNO.9，针对hsa-miR-92a-3p的SEQIDNO.10。3.根据权利要求2所述的大肠癌相关microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述P2序列选自：SEQIDNO.11～SEQIDNO.20；所述P5序列选自：SEQIDNO.31～SEQIDNO.40，
\t所述P7序列选自SEQIDNO.51～SEQIDNO.60；所述P4序列中的所述间隔臂序列为3—10个T；所述P6序列的间隔臂序列为2—10个T，所述P8序列为polyT。4.根据权利要求3所述的大肠癌相关microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述polyT为3-10个T。5.根据权利要求4所述的大肠癌相关micr...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘苏燕，吴诗扬，董艳，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44