一种用大蒜花序轴进行脱毒快繁的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种用大蒜花序轴进行脱毒快繁的方法。主要采用大蒜花序轴为外植体诱导不定芽，然后将不定芽诱导成试管鳞茎，通过低温驯化后的试管鳞茎栽培到土壤中获得脱毒种蒜的完整体系。每个花序轴诱导的不定芽数可以达到11个；诱导试管鳞茎的培养基为：MS+120g·L‑1绵白糖+6.8 g·L‑1琼脂，pH=7.5。本发明专利技术以宝坻大蒜“六瓣红”花序轴为外植体，通过高频诱导试管鳞茎、试管鳞茎低温春化、优化栽培条件等技术环节，构建了大蒜脱毒快繁完整方法，不定芽诱导试管鳞茎的诱导率最高可达到98.78%，而每个花序轴诱导的试管鳞茎数最高可达到10.64个，其繁殖系数相对于鳞茎直接种植高了2倍多。为提高大蒜脱毒快繁效率、节省培育时间、降低生产成本提供了技术保障。

Method for removing toxin and rapid propagation using garlic inflorescence axis and application thereof

The invention discloses a method for fast detoxification and rapid propagation of garlic inflorescence axis. The main purpose of this study was to induce adventitious buds by using the inflorescence axis of garlic as explants, and then to induce the adventitious buds into the bulb of the test tube. Each inflorescence axis induced adventitious buds can reach 11; medium bulb: MS+120g L 1 +6.8 g Sugar L agar 1, pH=7.5. The present invention in Baodi garlic \six red petals\ inflorescence axis as explants, induced by high frequency tube bulb, the bulb vernalization and optimization of cultivation conditions and other technical aspects, constructs the garlic virus-free propagation method, adventitious bud induction rate reached 98.78% and the number of induction of test tube bulb, bulblet per inflorescence axis by up to 10.64, the propagation coefficient relative to the bulbs planted directly up to 2 times as much. In order to improve the efficiency of garlic detoxification and rapid propagation, to save time and reduce production cost, it provides technical support.

【技术实现步骤摘要】
本专利技术得到天津市农委重点资助项目（201302030）；天津师范大学应用开发研究基金重点项目资助（52XK1210，52XK1505）。
本专利技术属于农业生物工程
，涉及大蒜组织培养与快繁的方法，更具体的说是构建一种用大蒜花序轴进行脱毒快繁的新方法。
技术介绍
大蒜(AlliumsativumL.)是百合科葱属一年生植物，大蒜栽培品种多不能形成种子，通常采用无性繁殖。这就使大蒜的生物多样性和遗传特性受到限制，造成严重的种性退化，严重影响大蒜的产量和品质。长期无性繁殖还导致大蒜病毒的不断积累，严重影响大蒜植株的生长及鳞茎的商品价值。当前，植物组织培养、人工诱变、基因工程以及大蒜多倍体育种等技术的应用，很大程度上提升了大蒜优良品种的选育工作。其中植物组织培养技术作为一种有效的脱毒快繁技术，已成大蒜育种研究热点。在大蒜的植物组织培养研究中，大蒜的不同外植体如，茎尖、根尖、幼嫩的叶子、贮藏叶、叶原基、未成熟的花序轴、鳞茎以及气生鳞茎等都已被应用于组织培养中用于诱导与再生。不定芽增殖途径是直接诱导外植体内潜伏的不定芽萌发，具有遗传性状稳定，突变率低，再生时间较短等优势。目前，大蒜不定芽增殖方式多选用茎尖和茎盘（等为外植体，其繁殖系数平均在3到7之间。花序轴是大蒜的生殖器官，处在生长顶端，病毒含量较低，其自然脱毒效果可以达到77.6%；花苞基部花盘有很高的诱导不定芽的潜力，王秀芝等以大蒜花序轴为外植体，诱导不定芽，每个花序轴不定芽总数可以达到19.2个。可见大蒜花序轴可以作为大蒜脱毒快繁的重要外植体。然而，许多研究者虽然获得了较多的不定芽，但脱毒种蒜高效培养成功的相关报道较为少见。因为高频率试管苗的诱导仅仅是脱毒种蒜生产的限速条件之一，如何保证这些试管苗生根、移栽成活进而获得脱毒种蒜是另一个重要条件。许多研究者采用离体培养技术从愈伤组织中获得了大量再生植株，但在诱导生根和移栽环节上损失大量植株，降低了繁殖效率，并且耗时耗力，在应用方面受到限制。有研究者通过优化大蒜再生植株的移植条件，提高其存活率，但植株驯化困难，效果不甚理想。熊正琴等将试管苗诱导形成试管鳞茎，其移栽成活率能明显提高。此外，试管鳞茎便于储存、方便运输、具有更强抗逆性以及无需驯化的优点，诱导成试管鳞茎的方式更加适用于大蒜组织培养。而且有研究表明，试管鳞茎与普通大蒜蒜瓣种植相似，经过其休眠期，便可以直接种植并正常生长。本专利技术以宝坻大蒜“六瓣红”的花序轴作为外植体，通过优化激素种类及浓度配比，获得高效诱导不定芽培养基，结合诱导试管鳞茎、改进栽培途径，构建了从外植体到脱毒种蒜生产的完整方法，该体系为大蒜脱毒、快繁、保持优良遗传稳定性、提高鳞茎产量及品质等提供了重要的技术依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开了一种用大蒜花序轴进行脱毒快繁的方法，它是按如下的步骤进行:（1）花序轴诱导不定芽：选择宝坻大蒜“六瓣红”，大蒜进入生殖生长期时，其花茎：假茎=1-1.2时，采摘大蒜的花序轴并于4℃中保存两周。将经低温储存两周后的花序轴置于自来水下冲洗30min，0.1%HgCl2消毒20min，蒸馏水冲洗3-4次，再用75%的酒精消毒10min，蒸馏水冲洗3-4次。剥下外层苞叶及表面退化的花原基残留物和膜质苞片，并去除花茎部分，将花序轴接入不定芽诱导培养基中，每瓶接入2个花序轴。诱导不定芽的培养基为:MS+2.0mgL-1KT+0.1mgL-1NAA+30.0g·L-1蔗糖+7.5g·L-1琼脂，pH=6.2。每个花序轴诱导的不定芽数可以达到11个；不定芽诱导试管鳞茎的诱导率均在90%以上，最高可达到98.78%，而每个花序轴诱导的试管鳞茎数最高可达到10.64个，其繁殖系数相对于鳞茎直接种植高了2倍多；（2）不定芽诱导试管鳞茎：花序轴生长六周后，形成的不定芽高度达到3-5cm时，将其接入诱导培养基中诱导试管鳞茎，所述的诱导培养基指的是试管鳞茎诱导培养基：MS+120g·L-1绵白糖+6.8g·L-1琼脂，pH=7.5，其详细的方法是：当花序轴诱导的不定芽生长六周后，形成的不定芽高度达到3-5cm时，将其接入另试管鳞茎诱导培养基中诱导试管鳞茎；（3）试管鳞茎的收获与储藏：不定芽在诱导试管鳞茎的培养基中诱导六周后，试管鳞茎成熟，将其取出并洗去培养基，在避光处晾干，晾干后，在4℃下保存3周后种植。（4）再生植株和再生鳞茎的获得：试管鳞茎度过休眠期后，于10月底种植，覆膜。第二年5月份，揭开薄膜，并进行除草，浇水以及松土工作。在6月下旬，组培大蒜成熟并收获；（5）组培大蒜病毒检测和染色体检测：利用酶联免疫技术和根尖细胞染色体制片技术分别检测组培大蒜脱毒效果和染色体变异情况，组培大蒜达到部分脱毒效果，未观察到染色体异常现象。本专利技术所述的NAA是a-萘乙酸（1-naphthlceticacid），简称NAA；KT是激动素（Kinetin）,简称KT；所述的MS基本培养基配方：每1L基本培养基中含有：KNO31900mg,NH4NO31650mg,MgSO4∙7H2O370mg,KH2PO4170mg,CaCl2∙2H2O440mg,MnSO4∙4H2O22.3mg,ZnSO4∙7H2O8.6mg,H3BO36.2mg,KI0.83mg,Na2MO3∙2H2O0.25mg,CuSO4∙5H2O0.025mg,CoCl2∙6H2O0.025mg,Na2-EDTA37.7mg,FeSO4∙7H2O27.8mg,甘氨酸2.0mg,盐酸硫胺素0.4mg,盐酸吡哆素0.5mg,烟酸0.5mg,肌醇100mg。本专利技术进一步公开了用大蒜花序轴进行脱毒快繁方法在提高大蒜脱毒快繁效率方面的应用，实验结果显示：本专利技术的方法是有效的，能够缩短大蒜制种时间，增大繁殖系数，由于不经过脱分化和再分化过程，可以最大限度保证了优良大蒜品种的遗传稳定性。本专利技术以大蒜花序轴为外植体，构建了从外植体选择、花序轴不定芽诱导、不定芽诱导试管鳞茎、试管鳞茎打破休眠、大田栽培种植、脱毒效果检测、遗传稳定性检测、直到脱毒种蒜获得的完整的方法。下面本专利技术以典型的天津市宝坻大蒜快繁为代表，更加具体的说明实施方案：1、花序轴诱导不定芽最佳培养基筛选：本专利技术所用的大蒜为宝坻大蒜“六瓣红”，材料来自于天津师范大学生物科技园中。选择于第一年10月底种植的宝坻大蒜“六瓣红”，大蒜进入生殖生长期时，其花茎：假茎=1-1.2时，采摘大蒜的花序轴并于4℃中保存两周。将经低温储存两周后的花序轴置于自来水下冲洗30min，0.1%HgCl2消毒20min，蒸馏水冲洗3-4次，再用75%的酒精消毒10min，蒸馏水冲洗3-4次。剥下外层苞叶及表面退化的花原基残留物和膜质苞片，并去除花茎部分，将花序轴接入筛选培养基中，每瓶接入2个花序轴。筛选培养基以MS为基本培养基，添加不同种类（KT，6-BA以及NAA）及浓度的激素，附加蔗糖30g·L-1，琼脂7.5g·L-1，pH=6.2，121℃(1.03×105Pa)灭菌20min后使用。以下为花序轴诱导不定芽的筛选培养基：表1培养基激素配比2、不定芽诱导试管鳞茎：花序轴生长六周后，形成的不定芽高度达到3-5cm时，将其接入另一种固体培养基中（MS+120g·L-1绵白糖+6.8g·L-1琼脂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用大蒜花序轴进行脱毒快繁的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）花序轴诱导不定芽：选择宝坻大蒜“六瓣红”，大蒜进入生殖生长期，其花茎：假茎=1‑1.2时，采摘大蒜的花序轴并于4℃中保存两周，将经低温储存两周后的花序轴置于自来水下冲洗30 min，0.1%（w/w） HgCl2 消毒20 min，蒸馏水冲洗3‑4次，再用75%（w/w）的酒精消毒10 min，蒸馏水冲洗3‑4次；剥下外层苞叶及表面退化的花原基残留物和膜质苞片，并去除花茎部分，将花序轴接入不定芽诱导培养基中，每瓶接入2个花序轴；诱导不定芽的培养基为: MS+2.0 mg L‑1 KT+0.1 mg L‑1 NAA+ 30.0 g· L‑1 蔗糖+7.5 g ·L‑1 琼脂，pH=6.2；（2）不定芽诱导试管鳞茎：花序轴生长六周后，形成的不定芽高度达到3‑5cm时，将其接入试管鳞茎诱导培养基中诱导试管鳞茎；（3）试管鳞茎的收获与储藏：不定芽在诱导试管鳞茎的培养基中诱导六周后，试管鳞茎成熟，将其取出并洗去培养基，在避光处晾干，晾干后，在4℃下保存3周后种植；（4）再生植株和再生鳞茎的获得：试管鳞茎度过休眠期后，于10月底种植，覆膜，第二年5月份，揭开薄膜，并进行除草，浇水以及松土工作，在6月下旬，组培大蒜成熟并收获；（5）组培大蒜病毒检测和染色体检测： 利用酶联免疫技术和根尖细胞染色体制片技术分别检测组培大蒜脱毒效果和染色体变异情况。...

【技术特征摘要】
1.一种用大蒜花序轴进行脱毒快繁的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）花序轴诱导不定芽：选择宝坻大蒜“六瓣红”，大蒜进入生殖生长期，其花茎：假茎=1-1.2时，采摘大蒜的花序轴并于4℃中保存两周，将经低温储存两周后的花序轴置于自来水下冲洗30min，0.1%（w/w）HgCl2消毒20min，蒸馏水冲洗3-4次，再用75%（w/w）的酒精消毒10min，蒸馏水冲洗3-4次；剥下外层苞叶及表面退化的花原基残留物和膜质苞片，并去除花茎部分，将花序轴接入不定芽诱导培养基中，每瓶接入2个花序轴；诱导不定芽的培养基为:MS+2.0mgL-1KT+0.1mgL-1NAA+30.0g·L-1蔗糖+7.5g·L-1琼脂，pH=6.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王振英，范宝莉，尚云涛，徐李薇，刘晓颖，党光，兰桂霞，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津;12