CpG DNA分子抗感染免疫制剂的制备和应用制造技术

该发明专利技术所属技术领域：１．生物技术，２．分子免疫学。本发明专利技术人工合成了能刺激猪、黄牛及牦牛等动物免疫细胞增殖活性的ＣｐＧ寡聚核苷酸序列，并提供了包装此段ＣｐＧ　　ＤＮＡ分子以制备抗感染基因纳米颗粒制剂的方法，公开了该ＣｐＧ纳米颗粒作为新型抗感染分子免疫增强剂的应用技术。该方法包括利用分子量１５００００、脱乙酰度９５％以上壳聚糖制备壳聚糖纳米颗粒，纳米颗粒分子包装ＣｐＧ寡聚核苷酸，将此制备的纳米颗粒制剂以肌肉注射或口服的方式单独或协同疫苗免疫实验动物，提高实验动物的特异性和非特异性细胞和体液免疫水平，提供了壳聚糖纳米颗粒包装ＣｐＧ寡聚核苷酸作为猪、黄牛及牦牛等动物新型抗感染分子免疫增强剂的应用技术。

【技术实现步骤摘要】

1.生物技术 2.分子免疫学
技术介绍
1984年，Tokunaga等人发现结核分枝杆菌的DNA除了一是种遗传物质外，还具有抗肿瘤特性，由此揭开了细菌DNA具有免疫刺激特性研究的新篇章，随后，他们通过一些研究认为这种免疫刺激特性是由具有自身互补回文结构的六核苷酸所引起的。至1995年，Krieg等人发现细菌DNA及某些人工合成的ODN(寡聚脱氧核苷酸)均具有免疫刺激作用，但这种作用与其是否具有回文结构并不一定相关，而是与这些DNA中具有的非甲基化的CpG结构单元(motif)密切相关，并将其定义为CpG免疫刺激序列(CpG)。CpG序列主要存在于细菌、病毒及无脊椎动物的基因组中，而脊椎动物基因组中较少，且大部分是甲基化的。CpG通常有一定的结构特征，即以CpG为核心，5′端紧接2个嘌呤碱、3′端紧接2个嘧啶碱。细菌DNA中这些未甲基化的CpG或者人工合成的含CpG的寡核苷酸(CpG-oligideoxynucleotides，CpG-ODN)在无需T细胞存在的情况惠，可直接激活B细胞，刺激B细胞分泌免疫球蛋白及IL-6。其产生的抗体呈非抗原性异性，细菌DNA诱导小鼠B细胞产生的抗体不仅能同细菌DNA发生抗原抗体反应，与其它DNA亦能发生交叉反应。除B细胞外，CpG亦可直接激活单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞，活化CD8+T细胞并促进其分化，诱导多种Th1型细胞因子如IFN、TNE、IL-1及IL-12等的分泌，这些因子进一步激活NK细胞并分泌IFN-γ，从而产生溶细胞活性。虽然细菌DNA及人工合成的CpG-ODN均有免疫刺激作用，但在某些细胞如巨噬细胞，细菌DNA作用强于人工合成的的CpG-ODN。Stcey认为，这可能是由于寡核苷酸比细菌DNA更容易降解，或者由于细菌DNA中不同免疫刺激序列的结合有更强的免疫刺激作用，或者用于大分子DNA更有效。21世纪人类健康问题日益突出，在以抗生素等化学药物有效治疗感染性疾病的同时，由此也产生了众多药源性疾病和细菌对抗生素的耐药性问题。目前由于过度依赖抗生素控制感染性疾病，导致病菌耐药性问题。近十多年来细菌对抗生素的耐多药、全耐药现象蔓延加剧，造成许多感染性疾病难以控制，如结核杆菌、0157大肠杆菌等引起的传染性疾病卷土重来，严重威胁着人类生命健康。目前迫切需要开拓全新的抗感染技术及药物，有效增强机体免疫抗感染能力，克服滥用抗生素的危害。近几年核酸分子免疫刺激序列的出现，为此带来了新的曙光。目前，已确定CpG序列对动物机体的免疫激活功能主要体现在以下两方面一是刺激B淋巴细胞增殖；二是激活单核细胞分泌细胞因子，进而导致自然杀伤细胞和Th1辅助T细胞激活，引发Th1特征的体液和细胞免疫反应。CpG-ODN的免疫刺激活性不仅与CpG基序和分子结构密切相关，而且具有动物种属特异性。目前CpG免疫刺激序列的应用研究主要集中在基因治疗、疫苗佐剂、肿瘤免疫等方面，而对其抗感染生物效应的研究较少。新近的研究表明，CpG基序除具有免疫调节功能外，对于控制胞内寄生细菌(李斯特菌，分支杆菌等)的感染也起重要作用，这一作用可依赖也可不依赖淋巴细胞，可望开发作为新型抗感染的免疫调节分子药物。因免疫途径和免疫方式不同，所涉及的抗原呈递细胞、抗原呈递方式均有不同，故可产生不同类型、不同强度的免疫应答。肌内直接注射和口服是简便且有效的两种途径。肌肉注射不需要额外的设备，且能在肌肉细胞中长期表达外源基因，因此它不仅是免疫动物的有效手段，而且还可应用于基因治疗。考虑到今后应用的简便性，口服也是一种可选的免疫方式。由于肌肉注射主要通过Th1细胞激活方式诱导免疫应答，效率较低，需要注射的DNA剂量较大，而口服经消化道所需的DNA量更大。因此，选择有效的包裹方式将抗感染DNA制剂靶向投递到抗原提呈细胞，以诱导强的体液免疫和细胞免疫，在应用免疫增强剂防治传染性疾病中至关重要。壳聚糖是天然生物多糖甲壳质的脱乙酰基衍生物，具有很好的生物相容性、可被体内多种酶类降解、降解产物安全无毒，并能被生物体完全吸收；而且由于其具有独特的聚阳离子特性，已有的研究结果显示它是一种具有很大潜力的缓释材料。近年来，在基因转染表达研究领域已出现了基于壳聚糖的纳米颗粒系统。大量研究表明，壳聚糖可包裹浓缩DNA，形成小的分散颗粒，将壳聚糖DNA复合物用于基因运载和转染表达时，能有效携带目的基因进入靶细胞中。包封于壳聚糖颗粒中的物质，其释放率主要决定于壳聚糖的生物降解和溶蚀，因此物质释放明显延长。初步研究结果发现基于壳聚糖的颗粒系统在生物医学方面具有广阔的应用前景。此外，壳聚糖还具有多种生物学功能，尤其是可作为药物增效剂。由于壳聚糖纳米颗粒良好的生物相容性使其在DNA制剂的包裹应用中显示了广阔的前景，因此利用壳聚糖纳米颗粒包装含CpG基序的寡聚核苷酸制备基因制剂，并将其应用于提高机体细胞和体液免疫水平、增强抗感染能力的应用技术，在科研，医疗，动物保健，和产业化方面具有潜在的巨大价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是利用壳聚糖为包裹材料制备含CpG基序的寡聚核苷酸基因制剂，并将此制剂用于抗感染的应用技术。该方法包括下列步骤1、CpG寡聚核苷酸序列及其引物的设计、合成CpG序列设计及合成CpG序列(见说明书第11页序列表)合成了含有11个CpG基序、长度为88个碱基的CpG寡聚核苷酸序列，其特点为含有3个5’-AACGTT-3’，3个5’-GTCGTC-3’，1个5’-GACGTT-3’，1个5’-ATCGAT-3’，1个5’-GTCGTT-3’，1个5’-GGCGTT-3’，1个5’-GACGTC-3’的特征序列。CpG序列引物设计及合成5’端CGAGATCTAACGTTGTC3’端CGAGATCTAACGTTAAC2、免疫用CpG寡聚核苷酸制备以合成的CpG序列为模版，利用PCR(多聚酶连链式反应)扩增，扩增产物溶解于灭菌生理盐水，用紫外分光光度计测其浓度。3、CpG寡聚核苷酸体外刺激动物血液免疫细胞增殖反应体外培养猪、牦牛及黄牛的淋巴细胞，制备靶细胞，分别将CpG寡聚核苷酸、CpG寡聚核苷酸和大肠杆菌疫苗、CpG寡聚核苷酸和副伤寒疫苗加入靶细胞中，利用MTT法检测了该CpG寡聚核苷酸及其协同疫苗对动物免疫细胞增殖活性的影响，发现该CpG寡聚核苷酸及其协同疫苗均能显著刺激猪、牦牛及黄牛淋巴细胞的增殖活性。4、纳米粒的制备利用离子交联法，以分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖制备纳米包装颗粒，将CpG寡聚核苷酸按一定比例加入壳聚糖溶液，磁力搅拌使其充分混合，制备CpG寡聚核苷酸壳聚糖纳米颗粒，并测定了纳米粒的形态、粒径及Zeta电位。结果显示制备的CpG寡聚核苷酸壳聚糖纳米颗粒表面带有正电荷，平均粒径为45nm；多分散度为0.190；zeta电位为+25.6mV。5、CpG寡聚核苷酸壳聚糖纳米颗粒抗感染制剂的应用昆明鼠120只，随机分为8组，每组15只。其中4组为非特异性免疫组，4组为疫苗免疫组。以肌肉注射和口服两种方式免疫小鼠，口服组CpG寡聚核苷酸免疫剂量为30pmol/头小鼠，壳聚糖纳米颗粒包装组为6pmol/头动物；疫苗免疫组每只小鼠接种1/40头份以及相应CpG寡聚核苷酸30pmol或壳聚糖纳米颗本文档来自技高网...

【技术保护点】
含ＣｐＧ基序的寡聚核苷酸抗感染免疫制剂的制备及应用，其特点包括含ＣｐＧ基序的寡聚核苷酸的人工合成、壳聚糖纳米颗粒的制备、壳聚糖纳米颗粒对含ＣｐＧ基序的寡聚核苷酸的分子包装及将此壳聚糖ＣｐＧ纳米颗粒免疫制剂应用于猪、黄牛、牦牛等动物抗感染增强机体免疫应答的技术。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：武梅，高荣，李惠，付满良，吴凯源，杨毅，章欢，程驰，刘狄广，李化，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]