一种检测哺乳动物血液中微量循环肿瘤细胞的特异性方法技术

本发明专利技术公开了一种检测哺乳动物血液中微量循环肿瘤细胞的特异性方法，依本方法设计的DNA纳米器件（PDN）可特异性的与循环肿瘤细胞表面高表达的蛋白特异性结合，并利用免疫磁珠分离技术将结合有PDN的循环肿瘤细胞从血液中分离。PDN可在酶和引物的作用下进行滚环扩增，其扩增产物能够与分子信标相结合实现荧光的释放和检测。荧光强度与PDN的数量直接相关，从而达到超灵敏检测血液中微量循环肿瘤细胞的目的。本发明专利技术的检测方法，不仅使检测变得超灵敏、更具特异性，且无需PCR仪等较昂贵的仪器，有效降低了检测成本，提高了检测效率，具有很高的临床应用价值。

A specific method for detecting circulating tumor cells in mammalian blood

The invention discloses a method for trace detection of circulating tumor cells in blood of mammals specific methods, according to the DNA nano device designed by this method (PDN) binding protein with high specificity expression specifically and circulating tumor cell surface, and using immunomagnetic separation technology will be combined with the circulating tumor cells isolated from the blood of PDN. PDN can be carried out under the action of enzymes and primers, and the amplified products can be combined with molecular beacons to achieve fluorescence release and detection. The fluorescence intensity is directly related to the number of PDN, so as to achieve the purpose of ultrasensitive detection of circulating tumor cells in blood. The detecting method of the invention, not only makes the testing become ultra sensitive and more specific, and without PCR instrument and other more expensive instruments, effectively reducing the cost of testing, improve the detection efficiency, has high clinical value.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测哺乳动物血液中微量循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCell，CTC）的特异性方法。
技术介绍
一般人们所说的“癌症”习惯上泛指所有恶性肿瘤，而肿瘤转移是肿瘤研究工作的困境之一，超过90%的癌症患者死于肿瘤转移。转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，也是临床绝大多数肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因。肿瘤细胞入侵到原发肿瘤细胞的周围组织中，进入血液和淋巴管系统，形成循环肿瘤细胞CTC，并转运到远端组织，再渗出，适应新的微环境，最终“播种”、“增殖”、“定植”、形成转移灶。因此早期发现血液中的CTC，对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。目前，新兴的CTC检测技术，已成为研究热点并进入临床应用。已经建立的CTC检测方法包括：聚合酶链反应和流式细胞术（Cellsearch系统）。但是，仪器的高成本、费力且耗时较长仍然严重制约着CTC作为肿瘤早期诊断的指标在临床中的应用。因此，有必要提供一种低成本、操作简单、灵敏度高及特异性强的检测微量CTC的方法。近年来，核酸适配体引起了很大的关注。​核酸适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列（RNA和ssDNA），具有特殊的三级结构，能与相应的配体进行强特异性和高亲和力的结合。作为一种新型的功能分子探针，核酸适配体因具有易合成及修饰、强稳定性、低成本等特点，而被认为是抗体的理想替代品。可见，适配体技术及其在生物医学的领域有着广泛的应用，可用于特异性识别靶细胞（尤其是癌症细胞），用于诊断治疗及生物传感等。基于适配体可特异性地识别癌症细胞的特点，同时结合免疫磁珠分离技术对血液中的循环肿瘤细胞进行分离。免疫磁珠分离技术是一种特异性强、灵敏度高及纯化性好的的免疫学检测方法和抗原纯化手段。目前，该项技术在细胞分离、蛋白、免疫学及微生物学检测等方面均取得了较大的进展，是最有推广价值的技术之一。其中，免疫磁珠分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。滚环扩增（RollingCircleAmplification，RCA）是一种高效的恒温核酸扩增手段，且可在短时间内实现DNA或RNA的指数扩增，通过结合生物标记等，有效地放大信号，极大地增强了检测灵敏度。近几年，RCA在功能性核酸的制备、生物传感及纳米材料等领域有着越来越广泛的应用。同时，RCA技术的发展得益于其自身高灵敏度和高特异性的特点，并且可以与其它高新技术（如表面修饰技术、荧光检测技术及纳米技术等）相结合，开辟更好的应用前景。本专利技术方法将适配体特异性识别结合相应配体的特点、免疫磁珠的捕获技术及RCA技术相结合用于微量CTC检测，具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、成本低的特点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测哺乳动物血液中微量CTC的特异性方法。本专利技术所采取的技术方案是：（1）微量循环肿瘤细胞表面高表达蛋白高特异性结合适配体AP的设计与合成：以待测血样外周血CTC表面高表达的蛋白为模板，基于Cell-SELEX技术，设计可与该蛋白高特异性结合的适配体AP；依据碱基互补配对原则，设计可与AP连接成多环的引物DNA1、DNA2；其中，DNA1和DNA2有两段相同的序列片段①和②，依据片段①设计滚环扩增引物（RCAprimer），依据片段②设计分子信标（MB）；（2）适配体AP成环反应得到CAP，使用同种方法得到环CDNA1和环CDNA2；（3）DNA纳米器件PDN的制备：将步骤（2）中得到的CAP、CDNA1、CDNA2以1:1:1-1:5:5的摩尔比混合，杂交，得到DNA纳米器件（PDN）；（4）微量循环肿瘤细胞所在的单核细胞层的分离：将待测血样用梯度分离液处理后，分离出目标CTC所在的单核细胞层；（5）DNA纳米器件PDN标记单核细胞层中的目标细胞CTC：将步骤（4）分离出的细胞与步骤（3）的产物PDN以及特异性的免疫磁珠混合共孵育；（6）免疫磁珠法分离PDN标记的CTC：利用免疫磁珠分离技术洗脱步骤（5）孵育液得到结合有PDN的目标细胞；（7）滚环扩增法测定微量循环肿瘤细胞细胞数：在步骤（6）产物加入RCAprimer进行滚环扩增，将分子信标MB加入滚环扩增产物中孵育，在碱基互补的竞争作用下，MB的发夹结构被打开，荧光信号释放后，检测荧光值，以此判断CTC的数量。使用本专利技术的方法，可以快速、高效地检测癌症患者外周血中CTC的数量。本专利技术的检测方法，避免了使用PCR仪、流式细胞仪等大型昂贵仪器及耗时长等问题，有效降低了癌症患者外周血中循环肿瘤细胞CTC的检测成本。本专利技术所述的检测方法便宜、简单，且与已有的检测方法相比，新方法所用时间短，具有高特异性、超灵敏的特点。本专利技术可用于癌症患者外周血中微量CTC的检测。附图说明图1：为本专利技术所述的PDN的各单独组分及PDN的电泳图（聚丙烯酰胺凝胶为12%）。图中：Maker泳道的DNA分子量标准（LowMolecularWeightDNALadder）；1泳道为：CDNA2；2泳道为：CDNA1；3泳道为：CAP；4泳道为：CDNA1+CDNA2；5泳道为：PDN。图2：图A表示的是荧光值与细胞数量的关系图，图B表示的是在518nm处的荧光最大吸收值与CTC数量的标准曲线。具体实施方式实施例1下面结合实施例，便于更好地说明本专利技术。乳腺癌病人外周血CTC的检测新方法的建立一、引物设计以待测病人血样CTC表面高表达的蛋白Epcam为模板，基于Cell-SELEX技术，设计可与Epcam蛋白高特异性结合的适配体EAD，EAD的序列为：CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTGGAATCAATCTGAATCAATCTACGACGTACTCCTAACTAGCT；依据碱基互补配对原则，设计可与EAD连接成多环的引物DNA1、DNA2；其中，DNA1和DNA2有两段相同的序列片段①和②，依据片段①设计滚环扩增引物（RCAprimer），依据片段②设计分子信标（MB）。所用到的引物序列如下：DNA1：TAGACTTAGTTAGATGCTGCTCCGCCCGTCCCACGTACTTTTTATGTTCTCTCTCTTGCCTCTGtcccacgtccgtctcDNA2：GGCAAGAGAGAGAACATAAATCCGCCCGTCCCACGTACTTATCTGAATCAATCTACGACGtcccacgtccgtctcRCA-primer：AGGGTGCAGGCAGAGMB：(FAM)GAGTCGCTCCGCCCGTCCCACGTACTTTTAAGGCGACTC(DABCYL)二、适配体环化与PDN合成将稀释为10μM的EAD进行成环反应，得到环CEAD，使用同种方法得到环CDNA1和环CDNA2；再将得到的CEAD、CDNA1和CDNA2以1:3:3摩尔比混合，反应条件为：90℃退火5min，降至室温，37℃反应1h，得到PDN产物。成环反应的具体步骤如下：（1）磷酸化反应：取1.5ml离心管，分别加入dd本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测哺乳动物血液中微量循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）微量循环肿瘤细胞表面高表达蛋白高特异性结合适配体AP的设计与合成；（2）适配体AP成环反应得到CAP；（3）DNA纳米器件PDN的制备；（4）微量循环肿瘤细胞所在的单核细胞层的分离；（5）DNA纳米器件PDN标记单核细胞层中的目标微量循环肿瘤细胞；（6）免疫磁珠法分离DNA纳米器件PDN标记的微量循环肿瘤细胞；（7）滚环扩增法测定微量循环肿瘤细胞细胞数。

【技术特征摘要】
1.一种检测哺乳动物血液中微量循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）微量循环肿瘤细胞表面高表达蛋白高特异性结合适配体AP的设计与合成；（2）适配体AP成环反应得到CAP；（3）DNA纳米器件PDN的制备；（4）微量循环肿瘤细胞所在的单核细胞层的分离；（5）DNA纳米器件PDN标记单核细胞层中的目标微量循环肿瘤细胞；（6）免疫磁珠法分离DNA纳米器件PDN标记的微量循环肿瘤细胞；（7）滚环扩增法测定微量循环肿瘤细胞细胞数。2.如权利要求1所述的一种检测哺乳动物血液中微量循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于：所述步骤（1）的适配体AP是基于Cell-SELEX技术，以微量循环肿瘤细胞表面高表达的蛋白为模板而设计合成的。3.如权利要求1所述的一种检测哺乳动物血液中微量循环肿...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾力，董海燕，王杰，韩龙宇，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建;35