桑葚病原菌高通量鉴定及种属分类方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种桑葚病原菌高通量鉴定及种属分类的方法。本发明专利技术通过收集桑葚病果；提取桑葚病果的总DNA；Illumina DNA文库构建；Illumina高通量测序；去除测序数据中桑树基因组序列；组装微生物基因组序列；组装完整核糖体DNA序列；筛选标记微生物核糖体DNA序列；对比分析核糖体DNA序列进行种属分类，实现对桑树病原菌的鉴定及种属分类。结果显示，运用本发明专利技术方法对桑葚菌核病病原菌进行鉴定及种属分类，共鉴定出3种真菌，其中相对丰度最高的为Ciboria属病原菌，据此确定桑肥大性菌核病病原菌为Ciboria，并根据比对结果，确定其为Ciboria carunculoides；该属大多数为植物病原菌，可导致植物的果实、种子出现僵化、膨大等症状，与研究的桑葚菌核病的病征相符合。

High throughput identification and pathogen of mulberry species classification method and its application

The invention discloses a high flux of mulberry pathogen identification and species classification method. The present invention by collecting Mulberry Disease fruit; total DNA extraction from mulberry fruit disease; construction of Illumina DNA library; Illumina sequencing; removal of mulberry genome sequencing data; microbial genome sequence assembly; complete ribosomal DNA sequences; screening marker microbial ribosome DNA sequence; comparative analysis of ribosomal DNA sequences for species classification the pathogen of mulberry, identification and classification. The results showed that the use of the method of identification and classification of pathogenic bacteria of Sclerotinia mulberry, identified 3 species of fungi, of which the highest relative abundance of Ciboria species of pathogenic bacteria, to determine the pathogenic bacteria of mulberry sclerotiniose was Ciboria, and according to the comparison results, identified as Ciboria carunculoides of the genus; the majority of plant pathogens, can cause plant fruits and seeds appear rigid, swelling and other symptoms, and the symptoms of mulberry Sclerotinia accord.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物病原菌鉴定及种属分类
，更具体地，涉及一种桑葚病原菌高通量鉴定及种属分类的方法。
技术介绍
近年来，随着蚕桑多元化发展和桑产业的兴起，桑不仅是以桑叶作为蚕桑产业中特种经济动物——蚕的饲料，更因其桑树本身的药理及营养价值，使得桑的多用途资源利用变得更加丰富。桑树全身都是宝，桑叶、桑椹和桑枝是目前种桑的主要目的收获物，桑椹作为桑科桑属植物的果实，又称桑果、桑葚或桑枣，被誉为“民间圣果”，自古以来就是百姓常采用的一种利尿，保健，消暑的鲜果，可制作果干、果汁，也可来泡酒。桑椹性味甘寒，具有补肝益肾、生津润燥、乌专利技术目等功效。因此桑果是人们植桑时，因桑葚具有较高的营养及食用价值，故桑果是除收获桑叶外具有较大经济价值的桑产物(陈冬梅，2013)。对桑果威胁最大的病害为桑菌核病。桑菌核病是果桑一种主要病害，俗称桑白果病，属真菌类病害；桑树开花时病菌开始侵入，桑果快成熟时病状显现，颜色呈白色，失去经济价值，大多数的果桑品种均较易发病，发病率可高达90％以上(蒯元璋等，2012)。桑椹菌核病(popcorndisease)分桑椹肥大性菌核病、桑椹缩小性菌核病和桑椹小粒性菌核病3种，俗称白果病。桑椹菌核病病菌以菌核在土壤中越冬，越冬后春季温暖、多雨、土壤潮湿利于菌核萌发，产生子囊盘多，病害重。在通风透光差，低洼多湿的桑园更适合病原菌的萌发与生长；花果多，树龄老的桑园，随着果桑养成年份的增加，菌核病病原(菌核或子囊盘)的田间残留量增加，也加大了菌核病爆发的可能性(娄利峰等，2016)。桑椹肥大性菌核病的植株花被厚肿，颜色呈现灰白，果实比较膨大，果实的中心有个黑色菌核，得病的桑椹破碎后会闻到一股臭味；感染缩小性菌核病的果实缩小，明显颜色呈现灰白，质地变得比较坚硬，表面会有暗褐色的细斑长出，内部存在黑硬菌核；小粒性菌核病的症状是果实体积膨大，果实内部长有小粒形菌核，果实呈现出病态的灰黑色，易脱落。桑椹肥大性菌核病病菌Ciboriashiraiana.称白杯盘菌(桑实杯盘菌)，属子囊菌门真菌。分生孢子梗丛生，基部粗顶端细小，上生分生孢子。分生孢子单胞，卵形，无色。菌核萌发产生1-5个子囊盘，盘内生子囊，侧丝细长，内有8个子囊孢子，子囊孢子椭圆形，无色单胞，具隔膜1-2个。桑椹缩小性菌核病病原菌为白井地杖菌Mitrulashiraiana，其分生孢子梗细丝状，具分枝，端生，卵至椭圆形、无色。单胞型分生孢子菌核会以两种方式长出子实体。子实体有灰褐色、扁平长柄，长有茸毛；子实体头部长椭圆形，具数条浅褐色纵向排列的稻纹，子囊生在头部外侧子实层里，长棍棒状，先端圆，基部细，内生8个子囊孢子，子囊孢子单胞、无色、椭圆形。桑椹小粒性菌核病病原菌为肉阜状杯盘菌Ciboriacanrunculoides，分生孢子接近于球形，较圆，子囊盘杯状，具长柄，子囊的形状近似于长棍棒，内部含有8个子囊孢子，子囊孢子单胞，无色，肾形，有半球形小体附着。侧丝有分枝，有隔或无隔。桑菌核病致病菌除上述的桑实杯盘菌、白井地杖菌、肉阜状杯盘菌外，最近陈倩茜(2015)报道从桑菌核病的样本中分离确定了一种新的病原菌，鉴定为拟茎点霉属(Phomopsis)的病原真菌Phomopsissp.SC1104，该病原菌可能与桑椹菌核病流行爆发有关。桑菌核病致病菌的寄主多样，病原可危害32科160多种植物，而桑菌核病还可与油菜等十字花科植物菌核病病原菌交叉感染(范锦等，2014；吕蕊花等，2015)，这给桑菌核病的防治带来了困难。植物病原菌分类一般以寄主的名称作为真菌种名的命名原则，同科同属且存在于同一寄主上的真菌无法在命名上和形态上区分开来，而若同种病原菌在不同的寄主间出现交叉感染情况，该病原菌的命名变得复杂而难以鉴别或区分，类似桑葚菌核病有多种病原菌感染的情况，对于其主要感染病原菌的鉴别，则需要分子生物学的技术加以辅助鉴别。真菌的系统分类方法中，更多的是以遗传物质的信息来佐证传统形态学的分类，并纠正一些主观分类的错误。现有的研究方法中，常用核糖体DNA(ribosomeDNA,rDNA)序列进行测序比对。rDNA中编码18S、5.8S、28S的rDNA序列较为保守，可用于真菌目、科、属等分类阶元的系统发育研究；内转录间隔区ITS位于核糖体rDNA18S、5.8S及28S之间，由于不需要加入成熟核糖体，因此在进化过程中能够承受更多的变异，其进化速率为18SrDNA的10倍，属于中度保守的区域，利用它可研究种及种以下的分类阶元。全基因组测序作为已经成熟且推广开来的一种测序，多用于基因的功能注释或进一步的比较基因组学研究。全基因组的高通量测序多用于已知菌株的功能基因的查找鉴定，用于真菌的种属鉴定，其准确性毋庸置疑。基于分子水平判定物种的技术已较为成熟，而测序的快速与成本低廉也使得这项技术变得更大众化。针对现有的桑葚菌核病病原菌的鉴定及种属分类研究中，受传统研究方法的限制，缺乏高通量技术、结果往往欠准确性，对桑葚菌核病病原菌进行定量检测方面几乎空白，因此本专利技术的方法具有前瞻性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有对桑葚病原菌鉴定不够准确的技术不足，提供一种准确性更高同时种属分类明确的鉴定及物种分类方法，并且检测对象是基于桑葚。本专利技术要解决的另一技术问题是提供所述方法在对桑葚病原菌进行定量分析方面的应用。本专利技术还一要解决的技术问题是提供所述方法在分析微生物物种丰度方面的应用。本专利技术还一要解决的技术问题是提供所述方法在计算物种间遗传距离方面的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：提供一种桑葚病原菌高通量鉴定及种属分类的方法，利用高通量测序手段及生物信息学分析方法，建立一种桑葚病原菌的快速、准确、高效的鉴定及种属分类方法。具体地，所述鉴定及种属分类方法包括以下步骤：S1.收集桑葚病果；S2.提取桑葚病果的总DNA；S3.IlluminaDNA文库构建；S4.Illumina高通量测序；S5.去除测序数据中桑树基因组序列；S6.组装微生物基因组序列；S7.组装完整核糖体序列；S8.筛选标记微生物核糖体DNA序列；S9.对比分析核糖体DNA序列进行种属分类；其中，步骤S2所述提取桑葚病果的总DNA的方法为：剪取桑病果中的患病区域，加入液氮充分研磨，用真菌DNA提取试剂盒按照其操作说明提取病叶总DNA，所述总DNA保存于-20℃冰箱；步骤S3所述IlluminaDNA文库构建的方法为：依照Illumina文库构建流程，将所述步骤S2中所述总DNA构建为片段大小400-600bp范围内的的双末端高通量测序文库；步骤S4所述Illumina高通量测序的方法为：用IlluminaHiseq2500测序仪对所述步骤S3中所述DNA文库进行高通量测序。步骤S5所述去除测序数据中桑树基因组序列的方法为：利用比对软件对步骤S4中所述高通量测序数据进行数据比对分析。选择比对算法，将所述测序数据与桑树参考基因组进行比对，并将比对上参考基因组的所述测序数据判定为桑树基因组序列。使用编写的计算机程序从所述测序数据中去除桑树基因组序列。S5所述去除桑树的基因组DNA序列选用的参考基因组序列为：桑属川桑(Morusnotabilis)全基因组序列(GCA_000414095.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种桑葚菌核病病原菌高通量鉴定及种属分类方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1.收集桑葚病果；S2.提取桑葚病果的总DNA；S3. Illumina DNA文库构建；S4. Illumina高通量测序；S5.去除测序数据中桑树基因组序列；S6.组装微生物基因组序列；S7.组装完整核糖体DNA序列；S8.筛选标记微生物核糖体DNA序列；S9.对比分析核糖体DNA序列进行种属分类；步骤S2所述提取桑葚病果的总DNA的方法为：剪取桑病果中的患病区域，加入液氮充分研磨，用真菌DNA提取试剂盒提取病果总DNA，所述总DNA保存于‑20°C冰箱；步骤S3所述Illumina DNA文库构建的方法为：依照 Illumina 文库构建流程，将所述步骤S2中所述总DNA构建为片段大小400~600bp的双末端高通量测序文库；步骤S4所述Illumina高通量测序的方法为：用Illumina Hiseq 2500测序仪对所述步骤S3中所述DNA文库进行高通量测序。

【技术特征摘要】
1.一种桑葚菌核病病原菌高通量鉴定及种属分类方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1.收集桑葚病果；S2.提取桑葚病果的总DNA；S3.IlluminaDNA文库构建；S4.Illumina高通量测序；S5.去除测序数据中桑树基因组序列；S6.组装微生物基因组序列；S7.组装完整核糖体DNA序列；S8.筛选标记微生物核糖体DNA序列；S9.对比分析核糖体DNA序列进行种属分类；步骤S2所述提取桑葚病果的总DNA的方法为：剪取桑病果中的患病区域，加入液氮充分研磨，用真菌DNA提取试剂盒提取病果总DNA，所述总DNA保存于-20°C冰箱；步骤S3所述IlluminaDNA文库构建的方法为：依照Illumina文库构建流程，将所述步骤S2中所述总DNA构建为片段大小400~600bp的双末端高通量测序文库；步骤S4所述Illumina高通量测序的方法为：用IlluminaHiseq2500测序仪对所述步骤S3中所述DNA文库进行高通量测序。2.根据权利要求1所述桑葚病原菌高通量鉴定及种属分类方法，其特征在于，步骤S5所述去除测序数据中桑树基因组序列的方法为：利用比对软件对步骤S4中所述高通量测序数据进行数据比对分析；选择比对算法，将所述测序数据与桑树参考基因组进行比对，并将比对上参考基因组的所述测序数据判定为桑树基因组序列；使用编写的计算机程序从所述测序数据中去除桑树基因组序列；S5所述去除桑树的基因组DNA序列选用的参考基因组序列为：桑属Morus川桑（Morusnotabilis）全基因组序列（Genbank登陆号GCA_000414095.2）及其叶绿体全基因组序列（Genbank登陆号NC_027110.1）；所述比对软件优选为bwa（0.7.12-r1039）软件；所述比对算法优选为mem比对算法；所述将测序数据与桑树参考基因组进行比对优选的是双末端比对方法和bwa（0.7.12-r1039）软件的默认参数；所述编写的计算机程序优选用python计算机语言编写。3.根据权利要求1所述桑葚病原菌高通量鉴定及种属分类方法，其特征在于，步骤S6所述组装微生物基因组序列的方法为：使用组装软件对步骤S5所述已去除桑树基因组序列的测序数据进行组装；所述组装软件优选为MetaVelvet（v1.2.01）。4.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘吉平，刘希，陈杰湖，刘伟强，黄志君，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44