可同时检测单核增生李斯杆菌、金黄色葡萄球菌和屎肠球菌的多重PCR检测方法技术

本发明专利技术根据单核细胞增多性李斯杆菌的hlyA基因，金黄色葡萄球菌的NUC基因与屎肠球菌的ddl基因分别设计引物，建立了能够同时检测这三种病原菌的多重PCR方法。该方法能够特异性的扩增单核细胞增多性李斯杆菌，金黄色葡萄球菌和屎肠球菌DNA片段，其最低检测量分别为、1.07pg、11.6pg和1.21pg。该方法对其他常见的致病菌无交叉反应。本发明专利技术所建立的多重PCR反应具有特异性强、敏感性高的特点，为临床上单核细胞增多性李斯杆菌、金黄色葡萄球菌和屎肠球菌的快速检测，鉴定以及流行病学调查提供了方便、快捷、准确的方法。

Multiplex PCR detection method for simultaneous detection of Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Enterococcus faecium

The present invention increased hlyA gene of Reese coli according to mononuclear cells, DDL gene and NUC gene of Enterococcus faecium Staphylococcus aureus were designed primers, established multiplex PCR assay for simultaneous detection of these three pathogens. The method was able to specifically amplify the DNA fragment of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium, with the lowest detectable amounts of 1.07pg, 11.6pg and 1.21pg, respectively. This method had no cross reaction with other common pathogenic bacteria. PCR multiplex set up by the invention has the characteristics of strong specificity, high sensitivity, clinical mononucleosis rapid detection of Reese coli, Staphylococcus aureus and Enterococcus faecium, identification and epidemiological investigation method provides a convenient, fast and accurate.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种多重PCR检测方法，尤其是一种耗时短、效率高、灵敏度高，可直接应用于同时检测单核细胞增多性李斯杆菌、金黄色葡萄球菌与屎肠球菌的多重PCR检测方法。
技术介绍
单核细胞增多性李斯杆菌病为人畜共患病，可引起皮肤感染、胃肠道紊乱，败血症。单核细胞增多性李斯杆菌主要是通过肠道感染，从肠道进入后第一侵害的靶器官是肝。在肝中单核细胞增多性李斯杆菌能大量繁殖，直到机体细胞免疫反应增强后才停止。单核细胞增多性李斯杆菌与结核菌、弓形虫虫体类似可以降低动物母体的细胞免疫的机能，从而使动物孕期母体出现免疫缺陷而导致怀孕动物或人出现早产流产现象、损害神经系统(脑炎、脑膜炎)。感染单增性李氏杆菌动物的死亡率高达7％以上。金黄色葡萄球菌同样为人畜共患病，不仅为患病动物携带该菌，在健康动物的体内也可分离到具有致病毒素的菌株。金黄色葡萄球菌可导致动物组织部位化脓，也能引起动物产生肺炎等疾病。由于该细菌感染的动物在产生败血症后还会继发性的引起脑膜炎，尤其多见于合并左心内膜炎的患者，通过细菌栓子经血流侵袭脑膜。肠球菌可引起人和动物感染，且屎肠球菌的感染率呈逐年上升趋势。肠球菌本身具有较强的耐药性，不易治愈，此病原菌已受到兽医临床工作者的重视。且单核细胞增多性李斯杆菌，金黄色葡萄球菌与屎肠球菌均可引起动物脑炎。在内蒙古中部地区一些羊场发生的以脑炎症状为主的感染病例中，分离得到脑源性金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯杆菌与屎肠球菌临床分离株。临床中单核细胞增多性李斯杆菌引起的动物脑炎病例较为常见，但由金黄色葡萄球菌、屎肠球菌引起动物脑炎病例较为少见。到目前为止，兽医临床对该病的诊断主要依靠病原的分离、鉴定，但是由于病原种类较为复杂，特别是李斯杆菌属的细菌种类较多，鉴定存在步骤繁琐、时间长等缺点，并且对单核细胞增多性李斯杆菌的分菌、试验具有较高的风险性，因此，建立快速、特异的PCR诊断方法对于该病的早期确诊和治疗具有重要的临床价值。目前，国内外针对这三种菌建立的多重PCR检测方法尚未见报道。本试验根据单核细胞增多性李斯杆菌Hyl基因与金黄色葡萄球菌NUC基因、屎肠球菌ddl基因序列设计其特异性引物，建立鉴别检测的多重PCR方法，为开展由金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯杆菌、屎肠球菌单一或混合感染性脑炎的快速鉴别诊断提供新的方法。本专利技术根据三种菌株的特异性基因设计引物，能够在多重或单一感染的病料中同时检测到这三种或鉴别其中单一病原，从而为本地区提供了一种可以快速诊断由此三种病原菌多重或单一感染的多重PCR检测方法。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在上述问题，提供一种耗时短、效率高、灵敏度高，可直接应用于同时检测单核细胞增多性李斯杆菌、金黄色葡萄球菌与屎肠球菌的多重PCR检测方法。本专利技术根据单核细胞增多性李斯杆菌Hyl基因、屎肠球菌ddl基因、金黄色葡萄球菌NUC基因，分别设计了1对特异性引物，在确定引物最佳浓度等反应体系的条件下，进一步确定了多重PCR扩增程序，由此建立了能够实现对单核细胞增多性李斯杆菌鉴定、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌同时检测或单一鉴别的多重PCR方法。本专利技术提供用于同时检测单核细胞增多性李斯杆菌、金黄色葡萄球菌与屎肠球菌的多重PCR引物，引物针扩增的基因分别为单增性李斯杆菌Hyl基因、屎肠球菌ddl基因、金黄色葡萄球菌NUC基因，其特征如下：本专利技术的技术解决方案是：一种可同时检测单核细胞增多性李斯杆菌、金黄色葡萄球菌与屎肠球菌的多重PCR检测方法，其特征在于依次按如下步骤进行：a.制备被检测物的DNA模板并置于反应管中；b.将单核细胞增多性李斯杆菌、金黄色葡萄球菌和屎肠球菌引物放入a步骤的反应管中进行多重PCR反应；所述单核细胞增多性李斯杆菌的引物序列为：hylA-1:5’-CATATATCTCAAGTGTGGCA-3’hylA-2:5’-GCAATGGGAACTCCTGGTGT-3’所述金黄色葡萄球菌的引物序列为：NUC-1:5’-GCATCACAAACAGATAACGGCG-3’NUC-2:5’-TAACCGTATCACCATCAATCGC-3’所述屎肠球菌的引物序列为：ddl-1：5’-GGACCCAAGTGGACAGACAG-3’ddl-2：5’-CTTCACCAGGCAAAGTCGTC-3’所述多重PCR反应条件为：94℃5min，94℃30s，59℃45s，72℃1min，共计35个循环，72℃终延伸5min；引物NUC-1、NUC-2、HylA-1、HylA-2、ddl-1、ddl-2浓度均为10μmol/μL；各引物的体积均为0.5μL、模板体积为1μL、去离子水为6μL、PremixTaq体积为10μL，总体积为20μL。本专利技术与现有普通PCR检测单核细胞增多性李斯杆菌、金黄色葡萄球菌和屎肠球菌相比，方法简单、耗时短、成本低廉，引物检测灵敏度高，从而为本地区提供了一种可以快速诊断由此三种病原菌多重或单一感染的新诊断方法，对由这三种菌引起的疾病的监测与预防提供了有效的工具，可有效减少经济损失。附图说明图1：特异性实验结果的多重PCR扩增图，其中各泳道如下，M:Marker；1:无模板阴性对照；2：大肠杆菌DNA；3：链球菌DNA；4：金黄色葡萄球菌DNA；5：无模板阴性对照；6：单增李氏杆菌DNA；7：绵羊李斯杆菌DNA；8：巴氏杆菌DNA；9：无模板阴性对照；10：屎肠球菌DNA；11：粪肠球菌DNA；12：芒地场球菌DNA；13：单增李斯杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌混合DNA。图2：敏感性实验结果的PCR扩增图，其中各泳道如下，M:Marker；1:无模板阴性对照；2-8:金黄色葡萄球菌DNA浓度分别为116ng-116×10-4ng；单增李斯杆菌DNA浓度分别为121ng-121×10-5ng；屎肠球菌浓度分别为107ng-107×10-5ng。具体实施方式实施例1.多重PCR方法1、试验菌株临床分离菌株：单核细胞增多性李氏杆菌、绵羊李氏杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪场球菌、芒地肠球菌、链球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌，试验所用菌株均由内蒙古农牧业科学院兽医研究所保存。2、主要仪器及试剂Biophotometer微量核酸检测仪购自Effendorf公司。DL600DNAMarker、细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。PremixTaq购自北京全式金生物技术有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。3、引物设计根据金黄色葡萄球菌耐热性透明质酸酶NUC，设计其属特异性引物NUC-1、NUC-2；根据单增性李氏杆菌透明质酸酶HylA基因，设计其种特异性引物HylA-1、HylA-2。根据屎肠球菌ddl基因，设计特异性引物ddl-1与ddl-2。引物序列及预期扩增片段长度见下表：4、多重PCR扩增参数引物NUC-1、NUC-2、HylA-1、HylA-2、ddl-1、ddl-2浓度均为10μmol/μL，PCR反应条件为：94℃5min，94℃30s，59℃45s，72℃1min，共计35个循环，72℃终延伸5min，配置体系各试剂体积见下表。5、多重PCR特异性试验为验证多重PCR反应的属特异性和种特异性，选取金黄色葡萄球菌属外革兰本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于同时检测单核细胞增多性李斯杆菌、金黄色葡萄球菌与屎肠球菌的多重PCR引物，其特征在于为：hylA‑1:5’‑CATATATCTCAAGTGTGGCA‑3’；hylA‑2:5’‑GCAATGGGAACTCCTGGTGT‑3’；NUC‑1:5’‑GCATCACAAACAGATAACGGCG‑3’；NUC‑2:5’‑TAACCGTATCACCATCAATCGC‑3’；ddl‑1：5’‑GGACCCAAGTGGACAGACAG‑3’；ddl‑2：5’‑CTTCACCAGGCAAAGTCGTC‑3’。

【技术特征摘要】
1.用于同时检测单核细胞增多性李斯杆菌、金黄色葡萄球菌与屎肠球菌的多重PCR引物，其特征在于为：hylA-1:5’-CATATATCTCAAGTGTGGCA-3’；hylA-2:5’-GCAATGGGAACTCCTGGTGT-3’；NUC-1:5’-GCATCACAAACAGATAACGGCG-3’；NUC-2:5’-TAACCGTATCACCATCAATCGC-3’；ddl-1：5’-GGACCCAAGTGGACAGACAG-3’；ddl-2：5’-CTTCACCAGGCAAAGTCGTC-3’。2.如权利要求1的多重PCR引物，其特征在于：引物针扩增的基因分别为单增性李斯杆菌Hyl基因、屎肠球菌ddl基因、金黄色葡萄球菌NUC基因。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘昆，宋越，刘威，张月梅，裴乐，陈伟，赵世华，
申请(专利权)人：内蒙古自治区农牧业科学院，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15