一种去氢甲睾酮抗原及其制备方法和检测试纸卡技术

本发明专利技术涉及一种去氢甲睾酮抗原及其制备方法和检测试纸卡，属于免疫化学检测技术领域。本发明专利技术提供的去氢甲睾酮包被抗原制备得到的试纸卡，包括塑料盒体，所述塑料盒体一端设置有加样孔，设置在所述塑料盒体中的试纸条，所述试纸条包括支撑层，设置在所述支撑层上的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线处设置有去氢甲睾酮包被抗原，所述质控线处设置有羊抗鼠IgG，所述结合垫上灌注有胶体金标记的抗去氢甲睾酮特异性单克隆抗体。本发明专利技术提供的去氢甲睾酮包被抗原制备得到的试纸卡操作简便，灵敏度高，特异性强，易于大范围推广应用。

Antigen for removing alpha testosterone and its preparation method and test paper card

The invention relates to a method for preparing the antigen and a preparation method thereof. The present invention provides metandienone coated paper prepared for antigen card comprises a plastic box body, the plastic box body is provided with a sample adding hole, setting the strip on the plastic box body, the test strip includes a support layer, a sample pad, in the support layer the gold labeled antibody binding pad, nitrocellulose membrane and absorbent pad, the cellulose nitrate film is arranged on the test line and control, the detection line is arranged at the metandienone coated antigen, the control line is provided with Goat anti mouse IgG, the binding pad filled with colloid the gold labeled anti metandienone specific monoclonal antibody. The test paper card prepared by the preparation of the coated antigen of the preparation method of the invention has the advantages of simple operation, high sensitivity and strong specificity, and is easy to be popularized and applied in a wide range.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫化学检测
，具体涉及一种去氢甲睾酮抗原及其制备方法和检测试纸卡。
技术介绍
去氢甲睾酮(1-dehydro-17a-methyltestosterone，DMT)，又名大力补、美雄酮，是一种人工合成的促蛋白同化类固醇激素。DMT能促进蛋白质合成、维持正氮平衡、增进食欲、促进钙磷在骨组织中沉积和新生组织的形成，因而在医学临床上常用于治疗再生障碍性贫血、男性发育迟缓、骨折及烧伤处理、手术后慢性消耗性疾病、老年骨质疏松和肿瘤恶液汁病等。DMT还具有促进动物体内营养物质沉积和改善生产性能的作用，在畜牧业生产中被用作饲料添加剂，以促进动物生长，提高瘦肉率。运动员服用DMT后能增强肌肉力量和体力，提高比赛成绩，因而也被违法应用到运动会和动物竞技比赛中。但DMT是一种蛋白同化激素，长期或大量服用会对人体有很多副作用，导致肝功能障碍、生殖功能紊乱，增加患心血管疾病的风险等。蛋白同化激素用作饲料添加剂时，会在动物体内残留。当人们长期食用含有该药物残留的动物性食品时，同样会造成人类生殖系统障碍、发育异常，提高乳房癌、睾丸癌等发病机率，严重危害人类健康。因此，欧盟自1986年以来就禁止在肉食性动物生产中以促进生长为目的使用人工合成的促蛋白同化激素。我国农业部2002年4月发布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中也明确规定性激素类原料药及其单方、复方制剂产品不准以抗应激、提高饲料报酬、促进动物生长为目的在饲养过程中使用。这就要求对食源性动物进行严格的激素滥用监控，以保护消费者的合法权益。DMT残留常用的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱－质谱法(GC-MS)和液相色谱－质谱法(LC-MS)等。这些方法灵敏度高，定性准确，可以确定化合物的分子量、分子式，甚至官能团，适合定量检测DMT含量。但这些方法成本高，需要专业的技术人员，昂贵的实验仪器及长时间的前期准备工作。而免疫学检测方法建立在抗体对抗原的分子识别上，其主要优点是抗原抗体的亲合力高、检测快速、经济实用，能够实现对生物液体的小体积、大通量检测，是最灵敏的方法之一。胶体金标记免疫分析法简便快速、成本低、无污染、无需培训，但现有去氢甲睾酮胶体金标记免疫检测方法灵敏度仍较低，一种能够实现去氢甲睾酮高灵敏度检测的抗原的研制对于保障动物性食品安全具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种去氢甲睾酮抗原及其制备方法和检测试纸卡。本专利技术提供的去氢甲睾酮抗原及其检测试纸卡操作简单、快速准确、灵敏度高、特异性强、成本低、稳定性好，可进行批量检测。本专利技术提供了一种去氢甲睾酮包被抗原，为去氢甲睾酮-鸡卵清白蛋白偶联物，具有式Ⅰ所示结构：式I中，OVA为鸡卵清白蛋白。本专利技术还提供了上述技术方案所述包被抗原的制备方法，包括以下步骤：1)将去氢甲睾酮溶于无水吡啶，得到去氢甲睾酮溶液；2)将所述去氢甲睾酮溶液与琥珀酸酐混合，在45～60℃避光进行酯化反应30～40h，得到去氢甲睾酮衍生物；3)将所述去氢甲睾酮衍生物溶解后进行酸化，得到去氢甲睾酮-琥珀酸酯；4)将所述去氢甲睾酮-琥珀酸酯与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于N,N-二甲基甲酰胺中，在35～40℃避光振荡条件下活泼酯法反应20～30h，得到去氢甲睾酮-琥珀酸酯活化中间产物反应液；5)将所述去氢甲睾酮-琥珀酸酯活化中间产物反应液逐滴加入鸡卵清白蛋白磷酸盐缓冲溶液中，偶联反应3～6h，得到去氢甲睾酮-鸡卵清白蛋白偶联物。优选的是，所述溶解淡黄色油脂状物用溶剂为质量分数为4～8％的碳酸氢钠溶液。优选的是，所述步骤3)中酸化后还包括：将酸化产物进行重结晶，所述重结晶用溶剂包括乙醚或四氯化碳。优选的是，所述步骤2)中去氢甲睾酮和琥珀酸酐的质量比为1：(0.6～1.5)。优选的是，所述步骤4)中去氢甲睾酮-琥珀酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量比为2：(0.8～1.5)：(2.5～3.5)。本专利技术还提供了上述技术方案所述去氢甲睾酮包被抗原制备得到的试纸卡，包括塑料盒体，所述塑料盒体一端设置有加样孔，设置在所述塑料盒体中的试纸条，所述试纸条包括支撑层，设置在所述支撑层上的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，其特征在于，所述检测线处设置有上述技术方案所述的去氢甲睾酮包被抗原或上述技术方案所述制备方法得到的去氢甲睾酮包被抗原，所述质控线处设置有羊抗鼠IgG，所述结合垫上灌注有胶体金标记的抗去氢甲睾酮特异性单克隆抗体。优选的是，所述包被抗原的浓度为0.2～0.3μg/ml。优选的是，所述抗去氢甲睾酮特异性单克隆抗体的浓度为0.1～0.2mg/ml。本专利技术提供了一种去氢甲睾酮包被抗原，为去氢甲睾酮-鸡卵清白蛋白偶联物。利用本专利技术所述去氢甲睾酮包被抗原得到的检测试纸卡因异源性检测方法而灵敏度高、特异性强，检测限可达0.5ng/ml；操作简单、方便快捷、成本低、易于大范围推广应用。附图说明图1为本专利技术实施例3提供的去氢甲睾酮包被抗原合成路线图；图2为本专利技术实施例5提供的试纸卡的结构示意图；图3为本专利技术实施例5提供的试纸卡的侧视图；图4为本专利技术实施例5提供的试纸卡的俯视图；图5为本专利技术实施例1提供的去氢甲睾酮免疫原合成路线图。具体实施方式本专利技术提供了一种去氢甲睾酮包被抗原，为去氢甲睾酮-鸡卵清白蛋白偶联物，具有式Ⅰ所示结构：式I中，OVA为鸡卵清白蛋白。式I中，OVA与去氢甲睾酮通过脱水缩合反应形成酰胺键。本专利技术还提供了上述技术方案所述包被抗原的制备方法，包括以下步骤：1)将去氢甲睾酮溶于无水吡啶，得到去氢甲睾酮溶液；2)将所述去氢甲睾酮溶液与琥珀酸酐混合，在45～60℃避光进行酯化反应30～40h，得到去氢甲睾酮衍生物；3)将所述去氢甲睾酮衍生物溶解后进行酸化，得到去氢甲睾酮-琥珀酸酯；4)将所述去氢甲睾酮-琥珀酸酯与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于N,N-二甲基甲酰胺中，在35～40℃避光振荡条件下活泼酯法反应20～30h，得到去氢甲睾酮-琥珀酸酯活化中间产物反应液；5)将所述去氢甲睾酮-琥珀酸酯活化中间产物反应液逐滴加入鸡卵清白蛋白磷酸盐缓冲溶液中，脱水缩合反应3～6h，得到去氢甲睾酮-鸡卵清白蛋白偶联物。本专利技术将去氢甲睾酮溶于无水吡啶，得到去氢甲睾酮溶液。在本专利技术中，所述去氢甲睾酮的质量和无水吡啶的体积比优选为(5～30)mg：3mL，更优选为20mg：3mL。本专利技术对所述去氢甲睾酮和无水吡啶的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人人员熟知的去氢甲睾酮和无水吡啶的市售产品即可。得到去氢甲睾酮溶液后，本专利技术将所述去氢甲睾酮溶液与琥珀酸酐混合，在45～60℃避光进行酯化反应30～40h。在本专利技术中，所述去氢甲睾酮和琥珀酸酐的质量比为1：(0.6～1.5)，更优选为1：0.9。在本专利技术中，所述酯化反应的温度为45～60℃，更优选为50℃；所述酯化反应的时间为30～40h，优选为36h。在本专利技术中，所述酯化反应优选进行搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速优选为50～200rpm。在本专利技术中，所述酯化反应后，优选对酯化反应产物进行干燥，得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种去氢甲睾酮包被抗原，为去氢甲睾酮‑鸡卵清白蛋白偶联物，具有式Ⅰ所示结构：式I中，OVA为鸡卵清白蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种去氢甲睾酮包被抗原，为去氢甲睾酮-鸡卵清白蛋白偶联物，具有式Ⅰ所示结构：式I中，OVA为鸡卵清白蛋白。2.权利要求1所述包被抗原的制备方法，包括以下步骤：1)将去氢甲睾酮溶于无水吡啶，得到去氢甲睾酮溶液；2)将所述去氢甲睾酮溶液与琥珀酸酐混合，在45～60℃避光进行酯化反应30～40h，得到去氢甲睾酮衍生物；3)将所述去氢甲睾酮衍生物溶解后进行酸化，得到去氢甲睾酮-琥珀酸酯；4)将所述去氢甲睾酮-琥珀酸酯与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于N,N-二甲基甲酰胺中，在35～40℃避光振荡条件下活泼酯法反应20～30h，得到去氢甲睾酮-琥珀酸酯活化中间产物反应液；5)将所述去氢甲睾酮-琥珀酸酯活化中间产物反应液逐滴加入鸡卵清白蛋白磷酸盐缓冲溶液中，偶联反应3～6h，得到去氢甲睾酮-鸡卵清白蛋白偶联物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述溶解淡黄色油脂状物用溶剂为质量分数为4～8％的碳酸氢钠溶液。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中酸化后还包括：将酸化产物进行重结晶，所述重结晶用溶剂包括乙醚或四氯化碳。...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜金庆，刘长忠，杨雪峰，王自良，范国英，张海棠，李广领，赵坤，赵恒章，李任峰，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：河南;41